鼠伤寒沙门菌cpxR和tolC双基因缺失株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

张梦珂,崔小蝶,吴 华,罗行炜,刘建华,翟亚军,贺丹丹,潘玉善,苑 丽,胡功政

(河南农业大学 动物医学院,河南 郑州 450002)

沙门菌(Salmonella)是常见的宿主范围广泛的人畜共患病原菌,具有高致病性和高死亡率[1,2]；目前已发现的沙门菌血清型已超过2600种,其中鼠伤寒沙门菌的感染率和发病率居沙门菌感染的首位,对公共健康和食品安全造成了严重的损害[3,4]。随着抗生素的广泛使用,食源性沙门菌的耐药性急剧上升,更严重的是导致了多药耐药(Multidrug resistance, MDR)沙门菌的出现[5]。双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system, TCS)是细菌中普遍存在的信号转导途径之一,具有广泛的调节功能,在细菌致病性和耐药性方面发挥着至关重要的作用[6,7]。CpxAR系统是在革兰氏阴性菌中普遍存在的TCS,由跨膜的感应子激酶CpxA和胞内的应答调节蛋白CpxR组成,可调控多种细菌致病性和耐药性的形成[8,9]。研究发现CpxAR对多种细菌的耐药性及MDR有重要的调控作用,例如可调控沙门菌、大肠杆菌等对β-内酰胺类、氨基糖苷类、阳离子类抗菌肽、磷霉素等药物的耐药性[10-12]。外排泵系统是介导细菌产生MDR的重要因素之一,外排泵活性的增加通常会增加细菌对抗菌药物的外排作用,其中AcrAB-tolC系统包括外膜通道蛋白TolC、内膜转运蛋白AcrB和周质蛋白融合蛋白AcrA,任何一个组分的缺陷都会导致外排功能的失活[13,14]。研究表明:抑制外排泵能逆转多种细菌对多种抗菌药物的耐药性,其中RND家族的外排泵活性与大肠杆菌和沙门菌的MDR密切相关[15,16],而TolC作为RND家族的多个外排泵的公用外膜通道蛋白,可能成为消除或抑制MDR的作用靶点[17,18]。

CpxAR的调控作用与外排泵系统的活性密切相关,在没有TolC依赖性外排的情况下,细胞内代谢物或信号分子蓄积,CpxAR系统被激活[19]。CpxAR能对某些代谢物产生反应,进而激活CpxR,再上调AcrAB-TolC的表达,从而调控对阳离子抗菌肽-精蛋白的抗药性[20]。迄今为止,TCS和外排泵系统之间的调控机制尚不明确,对TCS、外排泵和MDR之间的相互关系仍知之甚少。前期研究发现当鼠伤寒沙门菌的cpxR和acrB同时缺失时,菌株对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性与单基因缺失株相比进一步升高,但这仅是从acrB缺失时AcrAB-TolC外排泵与CpxAR系统之间的相互作用而言,而cpxR缺失与tolC缺失协同作用能引起哪些变化尚没有研究报道。因此,本研究通过噬菌体转导技术同时敲除RND外排泵家族的通用外膜蛋白基因tolC与cpxR基因,分析了其对常用抗菌药物的敏感性的变化,从JSΔcpxRΔtolC来观察CpxAR与外排泵系统之间的协同作用关系,以期为寻找消除或抑制MDR的作用新靶点并深入分析两者协同作用的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

鼠伤寒沙门菌标准菌种(CVCC541,命名为JS)源自中国兽医药品监察所,由本实验室保存。大肠杆菌ATCCR25922购自中国普通微生物菌种保存中心,作为质控菌。pCP20质粒、pBAD-HisA质粒均由本实验室保存;沙门菌噬菌体P22HT105/int由河南科技学院馈赠,本实验室保存。鼠伤寒沙门菌单基因缺失株JSΔcpxR和JSΔtolC::kan由本实验室保存。

1.2 主要试剂和药品

LB肉汤、LB琼脂、MH肉汤等培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司;DL2000和DL5000 DNA Marker购自宝日医生物技术(北京)有限公司;卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)和L-阿拉伯糖均购自Solarbio公司;环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟、痢菌净、头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素、土霉素、喹乙醇、氟苯尼考、头孢曲松、阿米卡星均为国产原料药,符合中国药典或中国兽药典质量标准,使用前置于4 ℃冰箱保存,使用时均在有效期之内。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank上已公布的鼠伤寒沙门菌的全基因组序列(HG326213.1),利用Primer 5.0设计tolC基因缺失鉴定引物：Tr-F为GCTTTACCTCGCCACTCATT；Tr-R为TGGGCGGTCACTTCATTC。根据黄慧等[21]的方法设计其他引物,其中Cr-F/Cr-R为cpxR基因缺失鉴定引物,Kr-F/Kr-R为kan基因鉴定引物,cpxR-F/cpxR-R为cpxR基因回补鉴定引物。各引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 cpxR和tolC双基因缺失株的构建

利用噬菌体转导技术,将本实验室前期构建好的tolC缺失株JSΔtolC::kan(tolC基因被kan替代)作为供体菌,将cpxR缺失株JSΔcpxR作为受体菌,在P22噬菌体的转导作用下,制备双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan。

1.4.1 噬菌体的增殖 挑取JS单菌落，将其接种于10 mL LB肉汤培养基,在37 ℃下振荡培养；当浓度达到108CFU/mL时,加入100 μL噬菌体原液,在37 ℃下静置20 min,使噬菌体充分吸附细菌,再在37 ℃下振荡培养5～8 h,可见菌液变澄清,说明细菌被噬菌体裂解。然后加入100 μL氯仿,充分振荡混匀,离心取上清液；最后用0.22 μm滤膜过滤,获得较纯的噬菌体,于4 ℃保存。

1.4.2 含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒的制备 挑取JSΔtolC::kan单菌落，将其接种于10 mL LB肉汤培养基中,于37 ℃下振荡培养过夜；然后加入适量的噬菌体增殖液,先在37 ℃下静置20 min,再在37 ℃下振荡培养5～8 h,获得含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒。

1.4.3 噬菌体的转导 挑取JSΔcpxR单菌落，将其接种于10 mL LB肉汤培养基中,在37 ℃下振荡培养过夜；将10 μL含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒与190 μL过夜培养的JSΔcpxR菌液混合,在室温下静置20 min；然后将其加入1 mL LB肉汤培养基,在37 ℃下振荡培养30 min；离心收集细菌沉淀,用100 μL LB肉汤培养基悬浮,然后涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB琼脂平板上,筛选JSΔcpxRΔtolC::kan阳性菌。

1.4.4 转导子的鉴定 挑取平板上的单菌落，将其接种于5 mL、含卡那霉素(50 μg/mL)的LB肉汤培养基中,在37 ℃下过夜培养；然后分别用鉴定引物Cr-F/Cr-R、Tr-F/Tr-R和Kr-F/Kr-R进行PCR鉴定,同时将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4.5kan基因的消除 将pCP20质粒电转导入JSΔcpxRΔtolC::kan中,涂布于含氨苄西林和卡那霉素的LB平板上，筛选阳性转化子,在30 ℃下培养过夜；将获得的阳性转化子转接于无抗性的LB液体培养基中,于42 ℃下培养数小时以消除pCP20质粒；挑取单菌落，将其分别转接于含氨苄西林、卡那霉素和无抗性的LB琼脂板上,在37 ℃下培养,获得在氨苄西林和卡那霉素平板上均不生长的突变株,说明kan基因已被消除,获得了双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC。

1.5 cpxR基因回补株的构建

将前期构建好的pBAD-cpxR重组质粒电转导入构建的双基因缺失株中,涂布于含氨苄西林的LB平板上筛选阳性转化子,用cpxR-F/cpxR-R进行PCR鉴定,并对PCR产物测序,构建cpxR回补株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR。

1.6 MIC值的测定

采用微量肉汤稀释法测定12种常用抗菌药物环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟、痢菌净、头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素、土霉素、喹乙醇、氟苯尼考、头孢曲松、阿米卡星的最小抑菌浓度(MIC),质控菌为大肠杆菌ATCCR25922,试验重复3次,结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 cpxR和tolC双基因缺失株的构建

2.1.1 JSΔcpxRΔtolC::kan转导子的鉴定 将含有ΔtolC::kan片段的噬菌粒与受体菌JSΔcpxR混合培养后,在含卡那霉素的LB琼脂平板上长出转导子,说明噬菌粒已将ΔtolC::kan片段传导给受体菌JSΔcpxR。挑取转导子的单克隆,用引物Cr-F/Cr-R进行PCR扩增,发现在cpxR缺失前、后片段大小分别为854和190 bp(图1A)；用Tr-F/Tr-R进行PCR扩增，在tolC缺失前、后的片段大小分别为938和2060 bp(插入了kan基因),如图1B所示；用Kr-F/Kr-R进行PCR扩增，鉴定kan基因，结果如图1C所示。测序结果也证实筛选的转导子为cpxR和tolC双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan。

2.1.2kan基因消除的鉴定 将pCP20质粒电转导入JSΔcpxRΔtolC::kan中,涂布于含氨苄西林和卡那霉素的LB平板上，在30 ℃下培养,获得了阳性转化子；再在42 ℃下培养阳性转化子，消除pCP20质粒,获得了在氨苄西林和卡那霉素平板上均不生长的突变株,获得了kan基因被消除的双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC。经PCR扩增,证实kan已被消除(图2)。测序结果证明cpxR和tolC双基因缺失株构建成功。

2.2 cpxR回补株的构建

将前期构建好的pBAD-cpxR重组质粒电转导入构建的JSΔcpxRΔtolC中,涂布于含氨苄西林的LB平板上筛选阳性转化子,经PCR鉴定,得到了714 bp的目的片段；对重组质粒进行双酶切鉴定,得到了4100 bp的载体条带和714 bp的目的条带,与预期结果一致；同时测序结果正确,说明回补株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR构建成功(图3)。

A：引物Cr-F/Cr-R的扩增产物; B:引物Tr-F/Tr-R的扩增产物; C:引物Kr-F/Kr-R的扩增产物; M:DL2000 DNA相对分子质量标准; 1:JSΔcpxRΔtolC::kan; 2:JSΔcpxR; 3:JSΔtolC::kan; 4:JS; 5:阴性对照。

A：引物Cr-F/Cr-R的扩增产物; B:引物Tr-F/Tr-R的扩增产物; C:引物Kr-F/Kr-R的扩增产物; M:DL2000 DNA相对分子质量标准; 1:JSΔcpxRΔtolC; 2:JSΔcpxRΔtolC::kan; 3:JSΔcpxR; 4:JSΔtolC::kan; 5:JS; 6:阴性对照。

A：引物cpxR-F/cpxR-R的扩增产物; B:双酶切鉴定JSΔcpxRΔtolC/pcpxR; M:DL2000 DNA相对分子质量标准; 1～3:JSΔcpxRΔtolC/pcpxR; 4:JS; 5:阴性对照; 6:质粒双酶切鉴定; 7:PCR鉴定。

2.3 MIC值的测定

MIC测定结果(表1)显示：与标准株JS相比,cpxR缺失株对大部分药物(环丙沙星、恩诺沙星、多西环素、土霉素、痢菌净、喹乙醇、头孢噻呋、氟苯尼考、头孢曲松)的MIC值保持不变,仅头孢噻肟、头孢喹肟和阿米卡星的MIC值降低至1/2;tolC缺失株对头孢曲松的MIC值保持不变,对其余11种抗菌药物(环丙沙星、头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、头孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、恩诺沙星、阿米卡星)的MIC值分别降低至JS的1/8、1/2、1/4、1/8、1/8、1/2、1/16、1/4、1/4、1/8、1/2;cpxR和tolC双基因缺失株对环丙沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、头孢曲松、阿米卡星的MIC值变化与tolC缺失株保持一致,而对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的MIC均又进一步降低至1/2;将cpxR回补到JSΔcpxRΔtolC中后,对环丙沙星、头孢噻肟、头孢噻呋、喹乙醇的MIC值升高至JSΔcpxRΔtolC的2倍,对恩诺沙星的MIC升高至4倍,对头孢喹肟的MIC升高至8倍。

3 讨论

噬菌体转导技术是利用噬菌体的吞噬、裂解和释放的功能来完成两个细胞之间遗传性状传递的一种技术。随着分子遗传学的发展,噬菌体转导已成为基因精细结构分析的常用方法,也是基因工程中常用的一种构建基因缺失株的方法[21]。在本试验中,以前期构建的JSΔtolC::kan为供体菌(△tolC::kan含有两端带有同源臂的1607 bp的kan序列),以JSΔcpxR为受体菌,利用P22噬菌体作为转导媒介，将tolC失活片段转移给cpxR缺失株,从而获得了携带kan基因的双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan。pCP20质粒是FLP重组酶的表达质粒,为温度敏感型复制子,在42 ℃条件下可诱导FLP重组酶的表达,质粒也随之逐渐丢失,在基因敲除的过程中用于消除FRT位点间的kan基因,从而最终得到双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC。

表1 双基因缺失株对12种临床常用代表性药物的敏感性检测结果(MIC) μg/mL

在本试验中,与鼠伤寒沙门菌标准株JS相比,cpxR缺失株对β-内酰胺类药物的敏感性增强,这是由于CpxA通过调节OmpF和AcrD的表达,以CpxR依赖性方式调控了肠杆菌科对β-内酰胺类药物的耐药性[10]。多重耐药泵AcrAB-tolC具有广泛的底物,包括氟喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类和氨基糖苷类等,前期研究发现在acrB缺失后,对β-内酰胺类、氟喹诺酮类药物的敏感性均增强；而本研究发现tolC缺失后不仅对β-内酰胺类、氟喹诺酮类的敏感性增强,而且对四环素类、喹噁啉类药物的敏感性也显著增强,这与tolC缺失后其它几个依赖TolC的RND外排泵的功能失活有关。Sulavik M C等发现：acrAB的缺失导致大肠杆菌对35种化合物中25种的敏感性增加；而tolC的缺失导致大肠杆菌对其中几种化合物的敏感性较缺失acrAB的菌株进一步升高[22],表明细菌对药物的敏感性是多个外排泵系统共同作用的结果。本试验发现，当cpxR和tolC同时缺失时,菌株对β-内酰胺类、四环素类、喹噁啉类药物的敏感性进一步升高,但对头孢噻呋、头孢曲松和土霉素的敏感性未发生变化,这可能是因为MDR的调控机制是复杂多样的,且不同药物的调控靶点和途径也不尽相同,即使是同一个外排泵或外膜蛋白对同一类不同种药物的外排能力和渗透能力也存在差别。而在cpxR回补后,对头孢噻肟、头孢噻呋、头孢喹肟的敏感性有所降低,证实了CpxAR可调控鼠伤寒沙门菌对β-内酰胺类药物的耐药性。

Taylor等研究发现: CpxAR的激活可上调霍乱弧菌RND多药外排系统VexAB和VexGH相关基因的表达,而VexAB和VexGH的缺失灭活可激活CpxAR系统,两者存在相互调控的关系[23]。刘雪玲等通过转录组分析发现，与WT菌株相比,ΔtolC中存在大量的基因上调表达,主要包括外排泵相关基因、转录调节因子以及CpxAR双组分调节系统中存在于周质间隙的辅助调节蛋白CpxP等[24]。相关研究证实大肠杆菌对β-内酰胺类的耐药性主要受5种RND家族的外排系统(AcrAB、AcrD、AcrEF、MdtABC和MdtEF)的协调调控[25]； Hu等的研究表明CpxR可调控沙门菌外膜蛋白和外排泵的表达量[26]。TolC既是外排泵AcrAB不可或缺的部分,也为RND家族另4个外排泵(AcrAD、AcrEF、MdtEF和MdtABC)完成功能所必需；依赖TolC的系统是毒力蛋白和抗菌药物普遍存在的排出路径,且它们的保守结构可能成为多药耐药病原体抑制剂的靶点[17]。然而, CpxAR与AcrAB-tolC协同调控MDR的深层次机制还需进一步研究。

4 结论

本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌标准株JS的cpxR和tolC双基因缺失株及cpxR回补株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR。cpxR和tolC缺失的协同作用调控菌株对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的敏感性。