HPLC 法测定弩药液中5个成分的含量

昝芳芳 崔 瑾

1.贵州中医药大学研究生院，贵州贵阳 550002；2.贵州中医药大学第一附属医院针灸科，贵州贵阳 550002

弩药液是传统苗医外治法中常用的外用药物之一，由嗟尚（大血藤）50 g、斗珍空（透骨香）50 g、嘎八叉赊（黑骨藤）30 g、包家利幼（生草乌）20 g、嘎炯豆丢劳（白龙须）15 g 组成，具有祛风除湿、舒筋活络、散瘀止痛的功效[1-3]。常搭配针具使用，由针具和弩药液结合成弩药针疗法，在苗族民间主要治疗风类疾病，现代临床中广泛应用于膝骨性关节炎、腰椎间盘突出症、颈椎病等痛症的治疗[4-7]。多年来，经苗族人民和现代临床不断验证，该疗法具有极其显著的临床作用，操作简单，安全性较高[8-12]。刘向阳[13]通过急性毒理试验，证明了弩药液经皮给药对动物的急性毒性小，通过镇痛抗炎试验得出弩药液能显著提高小鼠的痛阈，具有明显的镇痛效果，但是它的药理作用机制尚未阐明。目前苗医弩药针的研究现状仅停留于临床研究，弩药液的药理研究少之又少，其有效成分的含量测定方法亦少见。故本实验建立高效液相色谱法（HPLC）测定弩药液中5个具有抗炎镇痛作用活性成分的含量方法，为弩药液的临床疗效提供理论依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪LC-2030C 3D（日本岛津）；十万分之一电子天平（AUW120D，日本岛津）；高速离心机（TGL-16B，上海安亭科学仪器厂）；超声波清洗机（SB25-12DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司）。

弩药材购于贵阳市万东花鸟市场，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为正品。绿原酸对照品（批号：110753-201817，纯度≥98%）购于中国食品药品检定研究院；八角枫碱对照品（批号：DST190715-176，纯度≥98%）、儿茶素对照品（批号：DST190628-001，纯度≥98%）、新乌头碱对照品（批号：DST190613-025，纯度≥98%）、次乌头碱对照品（批号：DST190307-058，纯度≥99%）均购自成都德思特生物技术有限公司。乙腈（色谱纯，Tedia 公司），磷酸（色谱纯，科密欧化学试剂有限公司），其余均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 八角枫碱、儿茶素、绿原酸 色谱柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（C）-0.2%磷酸水溶液（A），梯度洗脱：0～25 min，5.0%C；25～35 min，5.0%～8.5%C；35～50 min，8.5%～8.8%C；50～60 min，8.8%～9.0%C；流速1.0 mL/min；检测波长：258 nm；柱温25℃；进样量10 μL。

2.1.2 新乌头碱、次乌头碱 色谱柱、流动相与“2.1.1”项相同，梯度洗脱：0～10 min，28%C；10～25 min，28%～33%C；25～35 min，33%～37%C；35～40 min，37%～40%C；流速为1.0 mL/min；检测波长：235 nm；柱温30℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 将药材切片放置1500 mL 玻璃容器内，加入50 度白酒1000 mL 密封，常温下浸泡14 d，浸泡过程中需每日轻轻摇荡1～2 次，待浸泡14 d 后，过滤出药液，弃去药渣，该原液需密封静置3 d，再过滤，装瓶，密封避光常温下储存备用。精密抽取弩药液2 mL，置于10 mL 容量瓶中，甲醇定容，摇匀，过滤，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取各对照品适量，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，即得含有八角枫碱6.294 μg/mL、儿茶素58.086 μg/mL、绿原酸17.900 μg/mL、新乌头碱6.018 μg/mL、次乌头碱2.890 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按“2.2.1”项下方法制备6 份分别缺大血藤、透骨香、黑骨藤、生草乌、白龙须、黑骨藤与大血藤的阴性样品溶液，过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性样品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见图1～2。

图1 八角枫碱、儿茶素、绿原酸HPLC 图

图2 新乌头碱、次乌头碱HPLC 图

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 至10 mL 量瓶，甲醇定容至刻度，摇匀，即得一系列浓度的对照品溶液。按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积。以对照品的质量浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数，结果见表1。

表1 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液各10 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果八角枫碱、儿茶素、绿原酸、新乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD 分别为0.929%、0.569%、0.472%、0.647%、0.481%，可见仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取上述供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下色谱条件测定。记录八角枫碱、儿茶素、绿原酸、新乌头碱和次乌头碱的峰面积，RSD 分别是2.662%、0.650%、1.147%、1.367%、1.165%，提示供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.5 重复性试验 取同一批次购买的弩药材，按供试品溶液制备方法平行制备6 份，进样测定。结果八角枫碱、儿茶素、绿原酸、新乌头碱、次乌头碱平均含量分别为2.195、3.713、3.718、1.669、1.121 mg/g，RSD 分别为1.402%、1.770%、1.461%、1.542%、1.421%，提示该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精准吸取已知含量的同一批次弩药液6 份，每份1 mL，置于10 mL 容量瓶中，分别精密加入适量的八角枫碱、儿茶素、绿原酸、新乌头碱、次乌头碱对照品溶液，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，进样测定，计算回收率及RSD，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.3.7 含量测定 取6 批弩药材，按“2.2.1”项下方法制备弩药液，再按“2.1”项下色谱条件测定。测得峰面积按标准曲线法计算出6 批次药材中5个化学成分的含量，结果见表3。

表3 弩药液中5个成分的含量（mg/g，n=6）

3 讨论

本课题组在前期大量的临床研究中发现弩药针疗法治疗膝骨性关节炎具有极其显著的临床疗效[14-17]，除针具的物理促渗作用外，弩药液有重要的作用。黑骨藤、大血藤属于藤类植物，均含有黄酮、皂苷、酚酸类化学成分，现代研究表明具有一定的抗炎、抑菌、抗氧化作用[18-20]。据文献报道白龙须、生草乌均含有生物碱、黄酮、皂苷等化学成分，经药理学研究证明具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用，而乌头属植物中二萜类生物碱的生理活性显著，是最主要的特征性化学成分[21-25]。故本实验筛选了生物碱类、酚酸类及黄酮类成分作为弩药液的指标性成分具有可行性。

本研究建立了弩药液中八角枫碱、绿原酸、新乌头碱等5种有效成分的含量测定方法，选取了弩药方中含量较高且与临床药效紧密联系的成分作为指标性成分。该方法操作简便，快速高效，灵敏度高，干扰性少，结果准确可靠，可用于弩药液的含量测定，能为临床用药的安全性和有效性提供理论支撑。