不同检测系统抗HCV抗体灰区样本检测一致性分析

陆银华，朱宇清，赵晓君，曹丹如，朱岭峰，顾志冬

（1.上海市临床检验中心，上海 200126；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025）

目前，用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）初筛的方法较多，如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）。对于弱阳性或强阳性样本，主流国产试剂的S/CO值高于进口试剂，但对于阳性或阴性样本，国产试剂的变异系数（coefficient of variation，CV）及特异性均明显低于进口试剂，导致出现较多的假阳性结果[1]。此外，HCV初筛试剂均未设定灰区范围，实验室对一些S/CO值较低，但>1的结果也发出阳性报告，因此可能存在大量的假阳性结果。为此，本研究拟对上海地区最常用的4家国产检测系统与由ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析仪（美国雅培公司）及配套试剂组成的检测系统（简称i2000SR检测系统）测定抗HCV抗体结果的一致性及相关性进行分析。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2012年1月—2014年7月上海市二、三级医院各临床实验室采用i2000SR检测系统测定的S/CO值为1.0～9.0的抗HCV抗体灰区样本120份，其中男性患者样本59份、女性患者样本61份，受检者年龄14～83岁，所有样本均采用确认实验[重组免疫印迹法（recombinant immunoblotting assay，RIBA）]确认为阳性。所有样本均无脂血、溶血，均未凝固。

1.2 方法

1.2.1 抗HCV抗体检测 分别采用ELISA[试剂盒分别购自上海科华生物工程股份有限公司（批号201403011）、上海荣盛生物药业有限公司（批号2014503202），检测仪器为Multiskan MK3酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司）]、TRFIA[ANYTEST时间分辨荧光分析仪（苏州新波生物技术有限公司）及配套试剂（批号8600013651）]、CLIA[CHEMCLIN 100型半自动化学发光仪（北京科美生物技术有限公司）及配套试剂（批号20140305）]检测抗HCV抗体。采用i2000SR检测系统（试剂批号32168L100、46355L100）进行复检。4种国产试剂与对应的仪器组成4种国产检测系统，随机编号为A检测系统、B检测系统、C检测系统、D检测系统，随机进行双孔复检，结果取均值。所有操作均严格按仪器和试剂说明书进行，每块酶标板均加入质控品一同检测，室内质量控制质控品（批号1401）由上海市临床检验中心提供。检测结果以S/CO值表示。抗HCV抗体国家二级标准品由国家卫生健康委临床检验中心提供，浓度为8 NCU/mL。

1.2.2 精密度（以CV表示）评价 参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2文件[2]提供的简易方案操作。将抗HCV抗体国家二级标准品（8 NCU/mL）倍比稀释，浓度分别为8、4、2、1、0.5 NCU/mL，每个浓度重复测定4次，连续检测5 d。计算不同检测系统测定不同浓度标准品的批内不精密度（批内CV）和总不精密度（总CV），比较不同国产检测系统标准品检测结果的线性关系。

1.2.3 一致性比对 比较4种国产检测系统与i2000SR检测系统不同S/CO值区间临床样本检测结果的符合率。将国产检测系统的定性结果按4种检测系统均阴性、任意1种检测系统阳性、任意2种检测系统阳性、任意3种检测系统阳性、4种检测系统均阳性分成5组，采用i2000SR检测系统检测5组样本，计算检测结果的±3s。

1.2.4 4种国产检测系统检测结果的相关性和一致性 计算4种国产检测系统检测弱阳性样本结果的相关性及一致性（Kappa值）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 精密度评价

对于不同浓度的标准品，A、B、C、D 4种国产检测系统的批内CV分别为17.6%～25.1%、0.8%～26.7%、7.8%～36.2%、0.7%～20.2%，总CV分别为15.9%～25.3%、1.0%～23.5%、7.7%～34.8%、3.4%～18.9%。除A检测系统外，B、C、D 3种检测系统的批内CV和总CV均随标准品浓度的升高而降低。对于浓度最低的标准品（0.5 NCU/mL），4种国产检测系统的批内CV和总CV均>15%。见表1。

表1 4种国产检测系统测定不同浓度标准品的不精密度结果

A、B、C、D 4种国产检测系统的线性相关方程分别为Y=0.634X+0.973、Y=2.495X+0.010、Y=1.348X+0.896、Y=2.510X-0.214。B、D 2种检测系统的斜率非常接近，分别为2.495和2.510。A检测系统和C检测系统的斜率低于B检测系统和D检测系统，且A检测系统的斜率最小（0.634）。各检测系统的CV也表现出相同的趋势。见图1。

图1 4种国产检测系统检测不同浓度标准品的线性

2.2 4种国产检测系统与i2000SR检测系统检测抗HCV抗体结果的符合率

对于S/CO值为1.00～3.00的样本，4种国产检测系统与i2000SR检测系统检测结果的符合率为34.2%～55.2%；对于S/CO值为3.01～6.00的样本，4种国产检测系统与i2000SR检测系统检测结果的符合率为57.5%～80.0%；对于S/CO值为6.01～9.00的样本，4种国产检测系统与i2000SR检测系统检测结果的符合率均>90%。见表2。

表2 4种国产检测系统与i2000SR检测系统抗HCV抗体检测结果的符合率 例（%）

2.3 4种国产检测系统检测结果的相关性及一致性

根据各检测系统的阳性判断值，对抗HCV抗体检测结果进行定性分析。120份i2000SR检测系统测定结果为阳性的样本中，4种国产检测系统均阴性的样本数为23份（19.2%），S/CO值的±3s为2.80±4.35；任意1种检测系统阳性的样本数为10份（8.3%），S/CO值的±3s为3.59±5.95；任意2种检测系统阳性的样本数为5份（4.2%），S/CO值的±3s为3.70±7.47；任意3种检测系统阳性的样本数为11份（9.2%），S/CO值的±3s为3.75±5.66；4种国产检测系统均阳性的样本数为71份（59.1%），S/CO值的±3s为5.13±7.84。

A检测系统与B、C、D检测系统的r值分别为0.712 5、0.760 0、0.837 0，Kappa值分别为0.666 3、0.598 5、0.742 6。B检测系统与C、D检测系统的r值分别为0.702 2、0.769 4，Kappa值分别为0.759 3、0.879 0。C检测系统与D检测系统的r值为0.736 4，Kappa值为0.664 8。B检测系统与D检测系统的一致性很好，A检测系统与C检测系统的一致性较差，其他检测系统两两之间一致性均较好。见表3。

表3 4种国产检测系统检测弱阳性样本结果一致性分析

3 讨论

抗HCV抗体是临床诊断HCV感染的主要血清学指标。ELISA、CLIA和TRFIA是目前临床实验室及采供血机构测定抗HCV抗体的主要方法，具有操作简便、快速、成本低、通量高、检测敏感性和特异性较高等优势[3-4]。但这些方法的影响因素较多[5]，且为定性检测。在临床实际工作中，常会遇到不同品牌的抗HCV抗体检测试剂测定结果不一致的情况，尤其是灰区样本，这不仅会影响对患者的临床诊断，还会导致献血筛查发生漏检[6]。目前，已有较多关于抗HCV抗体ELISA试剂之间的比对、可信度分析等的研究，但对于国产化学发光检测系统的评价较为少见。为此，本研究针对常用的国产ELISA和化学发光检测系统测定抗HCV抗体结果的一致性及相关性进行分析，综合评价不同检测系统检测结果的可信程度。

目前，主要的商品化抗HCV检测试剂盒均以HCV基因重组蛋白（由大肠埃希菌表达）或合成肽（核心区Core、NS3、NS4和NS5等蛋白片段）为抗原包被固相载体[7]，采用间接法原理进行测定。由于不同厂商使用的HCV抗原的组合、来源、用量等有一定差异，导致不同品牌试剂盒的抗HCV抗体检测结果有时会出现较大的差异[7-8]。本研究结果显示，各检测系统之间抗HCV抗体标准品的测定结果存在差异，B检测系统和D检测系统线性相关方程中的斜率非常接近，分别为2.495和2.510；而A检测系统和C检测系统的斜率均低于B检测系统和D检测系统，特别是A检测系统的斜率最低，为0.634，这使得A检测系统的测定结果与其他3个检测系统的差异较大。4种国产检测系统的不精密度（CV）也有类似表现，B、C和D 3种检测系统的CV较接近，而A检测系统的CV明显大于其他检测系统。由于这4种国产检测系统操作过程涉及的手工步骤较多，如加样、洗板、温育等，因此影响检测的因素较多，导致不精密度较大，特别是对于0.5 NCU/mL的抗HCV抗体标准品，4种国产检测系统的批内CV和总CV均>15%，与i2000SR检测系统的CV有一定的差异。

长期以来，检验结果的一致性一直是临床实验室关心的重要问题。本研究结果显示，对于抗HCV抗体浓度较高的样本，各检测系统之间的符合率随S/CO值的升高而升高。在临床实际工作中，检测结果一致性较差的主要是低浓度和临界值样本。因此，本研究对i2000SR检测系统S/CO值为1.00～9.00，且RIBA确认为阳性的样本进行了分析，评估不同检测系统之间结果的一致性，结果显示，对于S/CO值为1.00～3.00的样本，除B检测系统外，其他3种检测系统与i2000SR检测系统的符合率均未超过50%；随着S/CO值的增大，4种国产检测系统与i2000SR检测系统的符合率也随之升高。120份灰区样本中，4种国产检测系统测定均为阴性的样本为23份（19.2%），S/CO值为1.00～7.15，提示对于S/CO值≤7.15的样本，4种国产检测系统可能会出现假阴性结果。任意3种国产检测系统均阳性的样本的S/CO值（±3s）为3.75±5.66，提示S/CO值>9.41的样本，4种国产检测系统可以得出与i2000SR检测系统一致的结果。对于S/CO值为7.15～9.41的样本，各检测系统之间会出现不一致的结果。因此，对于这一区间的样本，应采取相应的复检措施，以提高不同检测系统测定结果的一致性。对于确认实验为阴性的样本，不同检测系统之间检测结果的一致性还有待进一步研究。

本研究相关性分析结果显示，4种国产检测系统两两之间均呈正相关，r值最高为0.837 0，最低为0.702 2；一致性检验结果显示，除A检测系统与C检测系统的Kappa值<0.6外，其他检测系统两两之间一致性均较好（Kappa值均>0.6[9]）。A检测系统与C检测系统一致性较差的原因可能与临界值阳性样本检测结果不符有关。

综上所述，对于抗HCV抗体灰区（S/CO值为1.00～9.41）样本，建议至少使用2种试剂进行复检，有条件的实验室可采用高特异性的试剂进行复检[7]，以确保检测结果准确、可靠。对于低浓度样本或临界值样本，应充分考虑到不同检测系统之间可能出现的结果不一致现象，制定合理的灰区范围，以便能更好地应用于临床。