壳聚糖-纳米纤维素复合涂膜对砂糖橘贮藏保鲜效果的影响

李保祥，余易琳，何 悦，郭丽榕，任 丹,，徐 丹,,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400700；2.西南大学食品贮藏与物流研究中心，重庆 400700）

柑橘味道甜美且营养丰富，是世界第一大类水果和第三大贸易农产品[1]。我国是柑橘重要的产地之一，柑橘品种丰富，种植面积和产量均居世界首位。但柑橘在我国仍以鲜食为主，且成熟时间较为集中，因此随着产量的不断提高，对柑橘贮藏和保鲜的技术需求也更加急迫。在采后贮藏过程中，柑橘的呼吸作用会不断消耗果实中的营养物质，使其衰老并口味变差，蒸腾作用则导致水分散失而引起枯水等问题，同时其果皮易受青霉菌和绿霉菌等微生物的侵染而腐烂，而低温贮藏则易发生冷害。因此，开发科学高效的柑橘采后贮藏技术是提高果实贮藏品质、降低果实腐烂率和延长货架期从而减少浪费并实现错峰销售，提升柑橘产业经济效益的关键[2]。目前，我国的柑橘采后贮藏保鲜技术仍以施加化学保鲜剂为主，常用的化学保鲜剂有百可得和咪酰胺（prochloraz，PCZ）等。长期使用这些化学保鲜剂会引起果实表面微生物产生抗药性而使药效降低，且使用过量会导致药剂在果实表面残留，对人体健康造成潜在危害。因此，开发安全高效的保鲜技术已成为该领域的研究热点。

可食性涂膜保鲜技术是将安全无毒的可食性高分子作为涂膜剂，将其涂布于果蔬表面，溶剂挥发后会固化形成一层阻隔性薄膜，由此来调节果实与外界的气体交换，抑制呼吸和蒸腾作用，减少果实在贮藏期间的营养损耗和水分散失，并可阻止外界病原菌的侵染，因而具有良好的保鲜效果[3-4]。壳聚糖（chitosan，CS）是一种具有优异成膜性和良好抗菌性的天然多糖[5]，在涂膜保鲜方面已进行了广泛的研究和应用。但CS薄膜的水蒸气阻隔性较差，且脆性高[6]，因此保鲜效果有限且结构容易被破坏。目前，有较多研究采用高分子共混或添加纳米材料以改善CS薄膜的性能。纳米材料如纳米二氧化硅[7]、纳米二氧化钛[8]、纳米氧化锌[9]、纳米银[10]等，均可有效提高CS的涂膜保鲜效果，但这些无机纳米粒子对人体的潜在毒性尚不清楚，用于果蔬的涂膜保鲜具有一定的安全风险。

纳米纤维素（nanocrystal cellulose，NCC）是一种直径小于100 nm，长度可到微米级的纤维聚集体，其绿色安全，具有较大的比表面积和良好的力学性能。本课题组前期将NCC添加到CS涂膜液中以制备复合涂膜，并用于红桔保鲜研究。结果发现该复合涂膜对果实腐烂率的抑制效果优于纯CS涂膜，且作用时间更为持久[11]。但不同品种的柑橘果实其采后生理活动和果皮表面结构差异较大，对涂膜的结构和性能等要求也不同，且前期研究仅表征了NCC对CS平板膜结构和性能的影响，未对涂膜的结构变化进行表征。因此，本研究选择了呼吸速率较高的砂糖橘（Citrus reticulatacv. Shatangju）为研究对象，在考察CS-NCC复合涂膜对其贮藏品质影响的同时，对果皮中丙二醛含量和抗氧化酶活力进行测定，并考察果皮和涂膜在贮藏期间的微观形态变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

砂糖橘采摘于重庆北碚区当地果园；CS（脱乙酰度为90%，分子质量为180 kDa）购自潍坊海之源生物制品有限公司；NCC分散液（质量分数为1.15%）购自天津市木精灵生物科技有限公司。

氢氧化钠、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、盐酸、考马斯亮蓝G-250、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（均为化学纯）重庆川东化工有限公司；福林-酚、碳酸钠、无水乙醇、冰醋酸、没食子酸（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；牛血清白蛋白（标准级） 重庆市钛新化工有限公司；过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；商业保鲜剂PCZ（450 g/L） 河北冠龙农化有限公司。

1.2 仪器与设备

WAY阿贝折光仪 深圳君达时代仪器有限公司；Synergy H1多功能酶标仪 香港基因有限公司；Dansensor CheckMate3台式顶空分析仪 美国Mocon公司；扫描电子显微镜 荷兰Phenom World公司。

1.3 方法

1.3.1 涂膜液制备及果实涂膜处理

1.3.1.1 涂膜液的制备

称取一定量的CS粉末溶解于体积分数为1%的冰醋酸溶液中，并于常温下搅拌24 h，得到质量分数为1.5%的CS-乙酸溶液，即纯CS涂膜液。分别称取一定量的NCC分散液加入制备好的CS溶液中，搅拌24 h后，制备得到NCC质量分数分别为2%和4%（以CS干质量计）的CS-NCC复合涂膜液。

1.3.1.2 果实涂膜与实验分组

选取当天采摘的大小均匀、外观完好的砂糖橘果实，用自来水清洗后再用体积分数2%的次氯酸钠溶液浸泡2 min，取出自然晾干。然后随机分为5 个组，每组约120 个果实。对照组记为CK，不再作任何处理；涂膜组分别在纯CS涂膜液以及NCC质量分数为2%和4%的CS-NCC复合涂膜液中浸泡2 min，取出后室温下晾干，分别记为CS、CS-2% NCC和CS-4% NCC组；最后一组在稀释1 000 倍的PCZ溶液中浸泡2 min，取出后室温下晾干，记为PCZ组。将上述各组果实置于常温下贮藏（平均温度为16 ℃，相对湿度为65%），每4 d每组取出8 个果实进行指标测定。

1.3.2 果实生理生化指标的测定

1.3.2.1 质量损失率

每4 d将各组果实逐一进行称质量并记录。按照公式（1）计算果实的质量损失率。

式中：m0为贮藏前果实的质量/g；mt为贮藏第t天时果实的质量/g。

1.3.2.2 腐烂率

每4 d观察一次果实，当砂糖橘表面出现水渍状淡褐色病斑且伴有白色菌丝体则标记为腐烂果实，并记录腐烂果实的数量。按照公式（2）计算各组果实的腐烂率。

式中：N0为该组果实的总个数；Nt为该组果实第t天的累积腐烂个数。

1.3.2.3 可溶性固形物质量分数测定

可溶性固形物质量分数采用阿贝折光仪进行测定[12]。

1.3.2.4 可滴定酸质量分数测定

可滴定酸质量分数采用NaOH滴定法进行测定[12]。

1.3.2.5 可溶性蛋白含量测定

可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法进行测定[12]。

1.3.2.6 VC含量的测定

VC含量采用2,6-二氯酚靛酚法测定[12]。将果实榨汁后用纱布过滤，取10 g果汁，用20 g/L草酸溶液定容至100 mL，提取10 min后过滤。取10 mL滤液用质量浓度为0.1 g/L的2,6-二氯酚靛酚溶液进行滴定，直到滤液出现粉红色且30 s内不变色。此时记录下消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液体积，按照公式（3）计算果汁中的VC含量，结果以mg/100 g表示。

式中：V1为滴定滤液所消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液体积/mL；V0为滴定草酸所消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液体积/mL；V为定容后果汁的总体积/mL；ρ是单位体积的2,6-二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸的质量浓度/（mg/mL）；VS为用于滴定的滤液体积/mL；m为称取的果汁质量/g。

1.3.2.7 总酚含量的测定

配制质量浓度为1 mg/mL的没食子酸标准品母液，将其稀释成质量浓度分别为0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01 mg/mL的溶液，然后分别取1 mL上述溶液与福林-酚试剂反应后，于760 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线（y＝9.109x＋0.055 3，R2＝0.975 2）。

总酚含量测定参照Tahir等[13]的方法并进行适当修改。取1 g过滤后的果汁，加入5 mL体积分数1%的盐酸-甲醇溶液，室温提取20 min后4 500 r/min速率离心10 min，收集上清液，即为总酚提取液。将福林-酚试剂用蒸馏水按体积比1∶9稀释后，取1 mL稀释液与1 mL总酚提取液混合，再加入2 mL质量浓度为75 g/L的Na2CO3溶液，常温下反应30 min后，测定该混合液在760 nm波长处的吸光度。按照公式（4）计算总酚含量，以每克果汁所含没食子酸质量表示。

式中：ρ为根据标准曲线得出的混合液中没食子酸的质量浓度/（mg/mL）；V为测定时所用的样品液体积/mL；m为称取果汁的质量/g。

1.3.2.8 丙二醛含量的测定

丙二醛含量参考余易琳等[11]的方法进行测定，结果以µmol/kg表示。

1.3.2.9 POD和CAT活力的测定

POD和CAT活力测定均按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 果实涂膜表面微观形态观察

从果实上切下面积不超过2 cm×2 cm的果皮，真空冻干后表面喷铂，采用扫描电子显微镜在10 kV电压下观察果皮表面的微观形态。

1.4 数据统计与分析

除腐烂率测定和扫描电子显微镜观察外，其余实验均重复测定3 次或以上。利用Excel 2016软件进行数据处理，采用Origin 2017软件作图，采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较进行显著性分析，P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 涂膜对砂糖橘贮藏品质的影响

2.1.1 质量损失率与腐烂率

在贮藏过程中，采后果实的蒸腾作用会导致水分不断散失[14]，使果实质量逐渐降低。从图1A可以看出，各组的质量损失率均随着贮藏时间的延长而增加，且组间差异逐渐显著。在整个贮藏期间，CS和CS-2% NCC组的质量损失率上升较快，尤其是CS-2% NCC组，在第24天时的质量损失率已经显著高于其他组。贮藏期间PCZ组的质量损失率最低，CS-4% NCC组的质量损失率则与CK组无显著性差异。由此说明，亲水性的CS涂膜不能很好地抑制果实在贮藏期间的水分散失，且会导致其质量损失率升高[15]，但添加适量的NCC可以增强涂膜的水蒸气阻隔性[16]，从而在一定程度上减少果实的质量损失。

图1 贮藏期间砂糖橘的质量损失率（A）和腐烂率（B）变化Fig. 1 Changes in mass loss rate (A) and decay incidence (B) of Shatangju mandarin during storage

砂糖橘的果皮较薄，在采后贮藏过程中极易被病原微生物侵染而腐烂，是造成其在贮藏期间经济损失的重要原因[17]。如图1B所示，CK组从第8天开始腐烂，且腐烂率增长较快，至第24天时已高达40%。而各处理组的腐烂速率则被较大程度地抑制，至第24天时，CS组和PCZ组的腐烂率较为接近，而CS-2% NCC和CS-4% NCC组的腐烂率最低，相较于CK组降低了约50%。CS本身具有一定的抑菌性，且涂膜可在果实表面形成一层保护性薄膜，以避免外界病原菌的侵染，从而起到和化学保鲜剂接近的抗菌效果。在涂膜中添加NCC可进一步增强涂膜的阻隔性和结构稳定性，使其保鲜效果更加持久。将NCC/CS复合涂膜应用于红桔保鲜也得到了类似的结果[11]。

随着果实成熟衰老及表面失水，砂糖橘果实外观及色泽也会发生变化。图2为果实贮藏12 d后的外观，与涂膜组相比，CK组和PCZ组的果皮出现了一定程度的皱缩，且缺少光泽，而涂膜后尤其是复合涂膜的果实则能较好地保持果皮的光泽度和新鲜度，有利于保持果实的商品性。

图2 贮藏12 d后砂糖橘果实外观Fig. 2 Appearance of Shatangju mandarin after 12 days of storage

2.1.2 果实营养物质含量在贮藏期间的变化

砂糖橘果肉中的可滴定酸、可溶性固形物、VC、总酚和可溶性蛋白等都是果实重要的营养指标[18]，它们的含量既受呼吸强度与相关酶活性变化的影响，也反映了果实的生理活动变化，更决定了果实的贮藏品质。

可滴定酸主要指果实中的有机酸，一般在果实发育完成时含量最高，随着果实的成熟与衰老其含量逐渐下降[19]。从图3A可看出，贮藏4 d后，各组果实的可滴定酸质量分数相较于第0天均明显下降。随着贮藏时间的延长，各组果实的可滴定酸质量分数均呈波动变化。这可能是由于果实中的酸含量本身存在较大的个体差异，且在贮藏期间内由于果实代谢作用的不断变化和多种因素的作用导致其含量不稳定。

图3 贮藏期间砂糖橘果肉中的可滴定酸（A）、可溶性固形物（B）质量分数以及VC（C）、总酚（D）和可溶性蛋白（E）含量的变化Fig. 3 Changes in the contents of titratable acid (A), total soluble solids (B),vitamin C (C), total phenol (D) and soluble protein (E) in the flesh of Shatangju mandarin fruit during storage

果实中可溶性固形物包括可溶性糖、酸、维生素和矿物质等，其含量与果实成熟度以及呼吸速率有密切的关系，是评价柑橘类果实品质的主要指标之一[20]。如图3B所示，砂糖橘在贮藏期间，各组的可溶性固形物质量分数均在第4天略下降，而后先升高再降低。可溶性固形物质量分数在贮藏初期下降，可能是由于果实中的可溶性糖等有机物在代谢过程中被转化为CO2和H2O而被逐渐消耗[21]。贮藏4 d后，果实细胞壁中的原果胶转化为可溶性糖，同时果实中的水分逐渐散失，均使得可溶性固形物质量分数上升；但同时可溶性糖在果实呼吸代谢中的不断消耗使其质量分数在贮藏后期开始下降。涂膜和保鲜剂处理可抑制果实的呼吸作用，降低了可溶性糖的消耗速率，从而推迟了其峰值的到来。CK组的可溶性固形物质量分数在第16天达到最高，而涂膜组和PCZ组则是在第20天或之后达到峰值。

VC又称抗坏血酸，是柑橘中重要的营养物质之一，可清理代谢产生的自由基，有助于延缓果实的衰老[22]。从图3C可以看出，各组果实的VC含量均呈现波动下降的趋势，这可能与果实在贮藏中后期果皮细胞膜遭到破坏有关[23]。在贮藏前8 d，各涂膜组果实的VC含量均显著高于CK组，但之后各涂膜组果实VC含量迅速下降并在贮藏16 d以后显著低于CK组和PCZ组，说明涂膜仅在贮藏初期能有效保持果实中的VC含量。

柑橘类果实中存在大量的酚类物质，与果实的色泽、品质、风味形成等有关，是衡量果实采后品质的重要次级代谢产物[24]。如图3D所示，贮藏过程中，果实中的总酚含量总体呈先上升后下降的趋势。贮藏前16 d，各组果实间的差异较小，但贮藏16 d之后，各组总酚含量均出现下降，这可能与果实的衰老有关[25]。其中，CK组的总酚含量下降最快，并显著低于涂膜组和PCZ组，可能是由于果实在衰老过程中消耗了大量的酚类抗氧化物质。而涂膜和PCZ处理可通过抑制果实的呼吸作用或减少微生物的侵染而延缓果实的衰老，因而能在贮藏后期维持相对较高的总酚含量。因此，经涂膜与商业保鲜剂处理的果实可以在一定程度上抑制总酚含量的下降。

可溶性蛋白是构成果实中酶的重要组成部分，参与果实多种生理生化代谢过程的调控[26]，其含量增加和积累能提高细胞的保水能力，对果实的生物膜起到保护作用。如图3E所示，在贮藏过程中，砂糖橘果实中的可溶性蛋白含量总体呈现波动性降低的趋势，且在贮藏初期（0～4 d）下降较快。贮藏至16 d后，各组间的差异增大。贮藏至20 d以后，涂膜组果实中的可溶性蛋白含量均显著高于CK组和PCZ组；而涂膜组中，CS-2% NCC和CS-4% NCC组高于CS组，说明涂膜有助于保持果实贮藏期间的可溶性蛋白含量，添加NCC则可进一步增强其效果。

果实的采后生理代谢受多种因素的影响，且个体差异较大，因此在贮藏期间，果实的上述营养物质含量均呈现一定的波动。但仍可看出涂膜处理有助于保持砂糖橘果实中的营养物质含量，尤其是在贮藏后期，涂膜组的可溶性固形物质量分数以及总酚和可溶性蛋白的含量均显著高于CK组。由此说明，对砂糖橘进行涂膜处理可提升果实的贮藏品质，但不同添加量的NCC对果实中营养物质含量的影响差异不明显。

2.1.3 涂膜对砂糖橘果实衰老的影响

在上述品质指标测定的基础上，本研究进一步监测了与砂糖橘衰老有关指标的变化，以探究复合涂膜对果实衰老过程的影响。在贮藏期间，砂糖橘果实中的活性氧以及膜脂过氧化产物含量逐渐增加，加速了果实的衰老和腐烂。丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可用作判断细胞膜损伤和细胞氧化程度的直接指标[27]。如图4所示，在贮藏前期（0～12 d），各组砂糖橘果皮中的丙二醛含量均快速增加，表明此时果皮的膜脂质氧化程度加剧，果实加速衰老。贮藏16 d后，PCZ组的丙二醛含量显著低于CK组，说明PCZ保鲜剂可有效延缓果实的衰老；而涂膜组中，CS组的丙二醛含量与CK组差异不明显，但在涂膜中添加NCC则可显著降低果实中的丙二醛含量，CS-4% NCC组的丙二醛含量在贮藏12～20 d过程中显著低于PCZ组。贮藏第24天时，CS-4% NCC组的丙二醛含量相较于同期的CK组减少了38%。由此说明，纯CS涂膜并不能有效抑制砂糖橘果皮的膜脂过氧化，但添加4% NCC的复合涂膜则可显著减轻果皮的膜损伤，而从延缓果实的衰老，其效果甚至优于化学保鲜剂PCZ。

图4 贮藏期间砂糖橘果皮中丙二醛含量的变化Fig. 4 Changes in MDA content in Shatangju mandarin peels during storage

柑橘果皮中的POD是一种重要的氧自由基解毒酶[28]，同时也能延缓果皮的酶促褐变[29]；CAT则是主要的过氧化氢清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用[30]。如图5A所示，在贮藏期间各组果实的果皮POD活力总体呈现波动性增加的趋势。在贮藏后期，组间差异增大，且CK组的POD活力明显低于涂膜组。而涂膜组中，CS-4% NCC组的POD活力在整个贮藏期间平稳增加，且在贮藏后期显著高于CK组和PCZ组，说明含4% NCC的复合涂膜可有效提高果皮细胞中的POD活力，从而减少果皮的氧化损伤[31]。

从图5B可以看出，各组砂糖橘果皮的CAT活力在贮藏期间均出现波动变化，但CK组果皮的CAT活力在整个贮藏期间均低于涂膜组，而PCZ组的CAT活力从第4天上升至较高水平后便迅速下降，并在后期低于涂膜组。而涂膜组中，CS-4% NCC组的CAT活力最高，在第16天时达到最大值（59.65 U/g），显著高于其他组，后期随着果实的衰老而降低，但仍高于CK组和PCZ组。由此说明，涂膜处理尤其是含4% NCC的复合涂膜处理，可有效保持砂糖橘果皮中的POD和CAT活力，有利于清除果实在生理代谢过程中产生的过氧化氢，从而增强果实的防御和抗衰老能力。

图5 贮藏期间砂糖橘果皮中POD（A）与CAT活力（B）的变化Fig. 5 Changes in POD (A) and CAT activity (B) in Shatangju mandarin peels during storage

2.2 果皮表面微观形态观察

图6为贮藏期间砂糖橘果皮表面的形态变化。第0天时，CK组和PCZ组柑橘表皮具有正常的蜡质层结构，且果实表面有尺寸为微米级的圆形气孔，而CS、CS-2% NCC、CS-4% NCC组表面均覆盖致密的聚合物。贮藏1 d后，CS和CS-2% NCC的涂膜表面出现了较多圆形微孔，大小和果实气孔接近，而CS-4% NCC组表面也有微孔出现但数量较少。此前，本课题组将CS和纳米蒙脱土复合涂膜用于红桔的保鲜时也发现了类似的现象[5]，可能是在果实的蒸腾和呼吸作用下，亲水性涂膜在气孔处的结构被破坏所导致。但涂膜在红桔表面出现微孔的时间是贮藏第5～7天，而砂糖橘在涂膜第1天即出现微孔，这可能是因为砂糖橘的呼吸和蒸腾速率高于红桔[11,32]，导致涂膜的结构更快被破坏。涂膜保鲜的机理一方面在于涂膜可抑制采后果实的呼吸，从而减少营养物质在呼吸代谢中的消耗，并减缓果实的衰老速率；另一方面涂膜可防止外界微生物对果实的侵染[5]。因此，涂膜中微孔的出现会降低其对果实呼吸强度的调节作用，同时减弱其对微生物的防护能力。但在CS涂膜中添加4% NCC可增强涂膜的结构稳定性，从而使涂膜更长效地发挥对果实的保护作用。因此，采用该复合涂膜处理的果实能够在贮藏后期仍然保持较低的腐烂率，较高的营养物质含量和较高的抗氧化相关酶活性。同时，贮藏至第24天时，CK组和PCZ组表面的蜡质层结构破坏较为严重，而蜡质层是柑橘果皮表面的天然保护层，具有防止非气孔性水分损失、延迟果实衰老及软化、保护果实免受病原体感染等重要的生理功能，对果实的采后贮藏品质有着重要作用[33]。而涂膜可在蜡质层表面形成一层保护层，减少蜡质层的磨损和破坏，这可能也是涂膜保鲜的机理之一[5]。

图6 砂糖橘果皮表面的微观形态（×500）Fig. 6 Microscopic morphology of the surface of Shatangju mandarin peels (× 500)

3 结 论

本研究以CS-NCC复合材料和纯CS对砂糖橘进行涂膜处理，并以化学保鲜剂PCZ处理组为对照，探究了复合涂膜对砂糖橘贮藏品质的影响。结果表明，纯CS涂膜对果实腐烂率的抑制效果与PCZ接近，而添加了NCC的复合涂膜则可进一步将腐烂率降低至对照组的50%。在贮藏过程中，涂膜处理有助于保持果实的营养物质含量，尤其是在贮藏后期，CS-4% NCC组具有较高的可溶性固形物质量分数以及总酚和可溶性蛋白含量。纯CS涂膜对果皮细胞的膜脂过氧化抑制效果不显著，但NCC质量分数为4%的复合涂膜则可显著抑制果皮中丙二醛含量的增加，并保持较高的POD与CAT活性，从而使果实有较好的抗衰老能力，且效果显著高于PCZ处理。对果皮表面微观形态进行观察发现，CS和NCC复合涂膜均可在砂糖橘表面形成致密均匀的膜层，且4% NCC的加入可增强涂膜的结构稳定性，从而延长其对果实的作用时间，增强保鲜效果。因此，添加NCC的复合涂膜可显著抑制砂糖橘的腐烂并提高其贮藏品质，其作为绿色安全的保鲜剂在柑橘保鲜中具有良好的应用前景。