以蜂蜡为基质纳米三氟氯氰菊酯制剂制备及杀虫活性研究*

李香荧,黄燕敏@,江 扬,陈 勇,甘春芳,崔建国

(1.南宁师范 大学化学与材料学院，广西 南宁 530100；2.广西田园生化股份有限公司，广西 南宁 530001)

0 引言

未来几十年，全球粮食系统将面临越来越大的压力，为给快速增长的人口可持续供给粮食成为全球农业部门面临的主要挑战之一[1,2]。据统计，全球每年农药的投入量达到460万t，90%以上的农药不能附着在喷洒的植物叶面上，直接进入环境，造成恶性循环[3]。农药的长期低效率使用造成一系列生态环境问题，农药难以降解造成土壤退化，通过土壤深入地下水，污染水资源，造成生物多样性破坏和生态退化，甚至让病害虫具有抗药性，危害人类和动物的健康[4-6]。因此，为了解决当前农药滥用的问题，必须引进新型农药。

运用纳米药物学的理论与方法，通过纳米载体、药效成分与助剂的有效复合[7-9]，创制具有靶向传输、智能释放、环境效应等功能的农药新剂型，是当前发展安全高效的绿色农药新产品的重要科学途径之一[10]。 目前纳米农药新剂型的研究主要集中在纳米微乳剂、纳米载药系统、纳米生物农药等领域。纳米农药制剂与传统农药制剂相比，使用的有机溶剂少，药剂颗粒比表面积大，分散性好，覆盖率大，黏附好，持效期长，生物利用率高[11]。对于易分解的农药来说，由于增加了包封保护，提高了农药的稳定性，并使之具有抗光解能力，从而延长了农药有效[12]。

蜂蜡是一种复杂的有机混合物，其主要成分是高级脂肪酸和一元醇所合成的酯类、脂肪酸和糖类[13]，蜂蜡具有抗菌性和抗紫外性能，能吸收220～400nm波段的紫外光[14]。Park J W[15]等人以壳聚糖和蜂蜡作为基质包裹溴氰菊酯，制备了一种聚壳糖-蜂蜡包裹溴氰菊酯固体脂质纳米制剂，粒径在244nm左右，所制备的纳米制剂具有良好的抗光解效果。Soleimanian[16]等采用蜂蜡、蜂胶和石榴籽油，通过熔融乳化-超声处理技术制备了功能性纳米结构脂质载体，该载体粒径范围在71～366 nm之间，具有出色的物理稳定性。Qiang[17]等以蜂蜡为基质包裹吸附在高岭土上的噻虫胺，或者以蜂蜡基质包裹噻虫胺，制备了具有控释作用的噻虫胺-蜂蜡微胶囊制剂，并测试了其对稻飞虱和甘蔗的茎蛀虫的杀虫效果，结果表明施药45天后仍保留90%的杀虫活性。

为了提高三氟氯氰菊酯的利用率，减少农药的滥用，本研究利用高速切割搅拌和超声分散的方法，并采用天然蜂蜡作为基质包封三氟氯氰菊酯，添加不同乳化剂和悬浮剂优化，制备得到稳定的纳米制剂。

1 实验部分

1.1 试剂与设备

三氟氯氰菊酯(LC，工业级，上海春农贸易有限公司)；蜂蜡(BW，工业级，东光县金涛蜡制品)；司班-20(分析纯，麦克林)；NS-500LQ(分析纯，南京捷润科技有限公司)；乙酸丁酯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

图1 三氟氯氰菊酯分子结构图

傅立叶红外光谱仪(布鲁克，型号：Thermo Scientific IS-10)，透射电子显微镜(日立医疗系统(苏州)有限公司，型号：S-4400N)，扫描电子显微镜(日立医疗系统(苏州)有限公司，型号：HT7700)，激光粒径仪分析仪(HORIBA，型号：SL-100)，紫外可见光谱仪(岛津企业管理(中国)有限公司，型号：UV-2600), 高压液相色谱(日本岛津，型号：AE，C18分析柱(130 A,1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg)，接触角测量仪器(上海中晨，型号：JC2000C1)。

1.2 蜂蜡-功夫纳米制剂(LC-BW)的制备

将司班-20放在40 ℃水浴至熔融状态，称3g司班-20加入124mL(61.95%)蒸馏水中，高速搅拌均匀(1000 r/min)，得到溶液1；准确称取蜂蜡2.16g，加入乙酸丁酯62mL，水浴加热至65℃，至完全透明后加入功夫菊酯原药(96.5%)5.2g，搅拌至溶解完全，趁热倒入溶液1中，高速搅拌30min(1800 r/min)，得到白色乳液，进一步在冰水浴中超声分散20min (过程中要搅拌)。最后加入NS-500LQ 3.4g，搅拌20 min(800r/min)至分散均匀，最后得到稳定的白色均匀悬乳液。

1.3 上载率和包封率

载药量(LC)定义为负载的质量在LC-BW制剂的固体颗粒中所占质量百分比，根据式(1)计算上载率。包封率(EE)定义为LC-BW制剂中被蜂蜡所包裹的与在制备中所加入的质量百分比，根据式(2)计算包裹率。

(1)

(2)

m：制剂中负载的质量/g；m0: 样品中质量/g；M: 固体样品的总质量/g

1.4 性能测试

1.4.1 红外光谱测定

取适量LC-BW制剂通过高速离心机分离，得到的固体通过真空冷凝干燥，然后将少量样品与溴化钾粉末研磨混合均匀，用压片机将混合物制作成薄片，傅立叶红外光谱仪进行测定。测试条件：4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.4.2 扫描电镜测定

把样品放入离心机离心，把离心得到的固体放入冷冻干燥机干燥。把准备好的样品取少量粘在导电胶上，用洗耳球吹去导电胶周围的粉末以防止样品污染，样品在喷金仪上喷金5min，采用电流为2～3mA，加速电压30 kV，喷金厚度为10nm，以增加样品导电性。采用扫描电子显微镜对样品进行拍照观察。

1.4.3 透射电镜测定

将制剂用蒸馏水稀释至1%的溶液，用1mL一次性注射器吸取液体一滴滴到含有碳支持膜的铜网上，用3%的磷钨酸进行染色，在室温下自然风干，将样品放入透射电子显微镜样品室中，进行观察和拍照。

1.4.4 动态光散射粒径测定

把用蒸馏水稀释至1%的浓度，用激光粒径仪分析仪测试，测试温度为25℃，散射光为90°，折射光为1.33，每个样品重复扫描三次，记录数据，取平均值。

1.4.5 缓释测定方法

用透析袋扩散法测定药物释放曲线(透析袋，北京格林博远生物科技有限公司，MD10mm)。称量一定量的LC-BW制剂样品，以市场上售卖的三氟氯氰菊酯悬浮剂(LC-SC)作对照，分别放入透析袋，两端用绳子扎紧，放入100mL的敞口瓶。然后往瓶中放入100mL的50%甲醇水混合溶剂(pH=7)。每个样品平行三个样，然后置于室温或的摇床中(转速180 r/min)。第3小时取第一次样，后面每隔12小时取样一次，每次取样后更换新鲜溶剂，放回摇床中。释出液采用紫外测定溶液的吸光度，通过标准曲线换算出LC含量。LC的浓度Ct由标准曲线y=0.050Ct-0.0023(y：吸光度abs，Ct：LC每次取样的浓度，R2=0.9997)计算对样品的累积释放率，采用式(3)来计算。

(3)

Q：累积释放率;W：样品中LC的总重量(mg);V：每次取样的体积(100 mL);Ct：LC每次取样样的浓度(mg/mL)。

1.4.6 LC-BW制剂抗光解测试

将LC-BW制剂用去离子水稀释至2 mg/mL，以相同浓度市场上售卖的三氟氯氰菊酯的悬浮剂(LC-SC)作为对照。然后在24孔培养板中每个孔放入1mL，用透明塑料薄膜密封培养板，将培养板置于40W UV灯下以45cm的距离照射。在预先设计的时间间隔(3,6,12,24,36,48,60,72,96，120小时)收集照射样品，并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度。经过0.22μm滤膜过滤，滤液通过高压液相色谱(设置波长为277nm)测定未分解的含量(流动相是甲醇∶蒸馏水=95∶5，流速0.3 m/min，保留时间12小时)，并计算其光解速率。

1.4.7 LC-BW制剂接触角测试

将LC-BW制剂中LC的浓度稀释至0.05%(w/w)，以市场上售卖三氟氯氰菊酯的乳油(LC-SC)和悬浮液(LC-EC)作为对照。收集新鲜植物叶片并平稳地固定在载玻片上放在样品台上，同时保持叶子处于自然状态而不破坏其结构。使用显微注射器抽取待测液体，然后在目标叶片表面注射μL液滴，30秒后，用接触角测量仪器拍照捕获液滴，计算液滴的接触角[25±2℃下的5点拟合分析方法，相对湿度为(25±2)%]，每个试样测试五个平行样品，然后取其平均值。

1.4.8 LC-BW制剂杀虫活性测试

(1)不同浓度LC-BW制剂的杀虫毒性

试验设5个处理组，每个处理40头黏虫，3次重复，共63个小区(有三个空白区)。将LC-BW制剂用水分别把浓度兑成450ppm,150ppm,50ppm,16.7ppm和5.6ppm，每个浓度用烧杯装150 mL溶液供浸叶所用。将新鲜玉米叶片剪切成5～6 cm小叶片(每个培养皿放置两张小叶片)，将小叶片浸泡在相应浓度药剂中处理10秒，然后取出小叶片，放置在干净的纸上风干，再进一步转移到培养盒中供试虫(螟虫，三龄中末期)取食，用具有小孔的塑料盖密封。培养盒置于害虫防治室中饲养[光∶暗=16∶8，温度= 25±2℃，相对湿度=(75±5)%]，48小时后调查虫子的死亡率。

计算方法如下：

(6)

(2)LC-BW制剂盆栽持效性测试

将适量土壤置于φ28×20cm塑料盆中，然后在每个盆中种植玉米种子5颗，每2天浇水一次。 植物在温室中生长15天后，在不同的时间间隔(0,4,8,12,16,20天)用刷子分别把浓度为100ppm的LC-BW制剂、LC-SC制剂和LC-EC制剂均匀涂抹在叶子上，其中保留3盆没有喷洒制剂作为空白对照。最后，收集试验植物的叶子，并剪切成适当的大小按照上面1.4.8(1)的测试方法测定其杀虫活性，按照不同时间节点的杀虫死亡率作图确定样品的杀虫持效期。

1.5 统计分析

实验的所有数据均以平均标准偏差(S.D.)表示，并使用单向ANOVA和Duncan多范围检验检查了实验重复之间的显着差异。 p<0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析

由图2可以看到，三氟氯氰菊酯中1725cm-1是酯基伸缩振动吸收峰(-C=O)，在1 003 cm-1出现的是芳香醚的峰，是LC的特征峰。而被蜂蜡包裹的LC同样也出现了这些特征峰，说明其结构并没有发生改变，只是物理性的被包裹在蜂蜡中[18]。

图2 LC-BW制剂红外可见吸收光谱图

2.2 动态散射测试

制剂的颗粒的粒径为150～250nm。上载率LC是31.47%±0.03，包裹率EE是96.31%±0.04。图3所示是LC-BW制剂的动态光散射(DLS)图，从图中可以看到制剂颗粒粒径比较均一，平均粒径在196.65±0.95nm。

图3 LC-BW制剂粒径分布图

2.3 扫描电镜和透射电镜

图4分别是LC-BW制剂的扫描电镜和透射电镜分析图，由图4可以看到制剂中的纳米颗粒大小分布均匀，轮廓清晰，颗粒形状为圆球状，粒径为120～180nm，颗粒之间没有发生团聚。

扫描电镜图 透射电镜图图4 LC-BW制剂扫描电镜和透射电镜

2.4 储存稳定性分析

表1为LC-BW制剂在经过冷热储后，其外观形态没有发生任何改变，没有出现分层或凝聚现象。制剂在常温时粒径为196.7±1.0nm，LC含量为2.927%。经过在54℃ 14天的热储后，粒径为237.8±7.3nm，LC含量为2.793%，降解率为4.6%，符合相关要求；经过14天,温度为4℃的冷藏，粒径为204.0±6.2nm。制剂在室温存储一年后，外观形态未见改变。

表1 LC-BW制剂储存过程中粒径和形态变化

2.6 LC-BW制剂的控制释放测试[19]

2.6.1 在50%甲醇水中的释放

由于原药LC与LC-BW制剂基本不溶于水，所以采用50%的甲醇-水作为释放介质，采用作为对照。从图5可以看到，在室温和pH=7的条件下，原药LC在最初6小时已经释放35%，而LC-BW制剂释放率没有超过10%，这是没有被包裹的在释放。到了108小时的时候，原药LC基本停止释放；而LC-BW制剂还在比较均匀地释放，到192小时才释放约51%。总体上来看，LC-BW制剂释放率比原药减缓50%以上。

图5 LC-BW制剂在50%甲醇水溶液释放图(25℃，pH=7)

2.6.2 LC-BW制剂在不同温度时的释放

LC-BW制剂在pH=7的50%甲醇水溶液中不同温度时的释放曲线(图6)，由图6可以看到，在常温时和45 ℃时有不同的释放速率，45 ℃时，9小时制剂已经释放约25%，说明此时被包裹在蜂蜡中的LC已经开始释放；而在常温下的制剂至9小时后释放率约10%，释放的未被包裹。随着时间推移，45 ℃时制剂释放越来越快，而常温下的LC-BW制剂在缓慢释放。也就是说温度越高，释放速率越快，LC-BW制剂的释放具有温度可控。这是由于温度的升高，促进了包裹蜂蜡层的膨胀，从而促进了LC的释放。

图6 LC-BW制剂在不同温度下的释放曲线图(50%甲醇水，pH=7)

2.6.3 LC-BW制剂在不同pH时的释放

图7是在室温和50%甲醇-水的条件下，LC-BW制剂在不同pH值时的释放曲线图。从图可以看出，酸性条件下LC释放速率比中性条件要快。在pH=7时，前9小时是释放未被蜂蜡包裹的，9小时后开始释放被蜂蜡包裹的，每隔12小时释放率约4%；而pH=5时，3小时前是释放未被包裹的，以后开始释放蜂蜡包裹中的，第9小时后都是比较均匀的释放，每隔12小时释放率是5%左右即酸性条件下释放速率比中性要快。由于碱性条件下LC不稳定，易于分解，因此碱性条件下得不到其释放数据。

图7 LC-BW制剂不同pH下的释放曲线图(25 ℃，50%甲醇-水)

2.7 LC-BW制剂抗光解性能评价

图8是LC-BW制剂的光解效果图，对照组为LC悬浮剂(LC-SC)，采用45W的紫外灯模拟太阳光对制剂照射。从图8可以看到，在前3小时已经分解60%，36小时时已经被分解完毕。而LC-BW制剂延长至72小时才完全光解。结果表明LC被蜂蜡包裹后具有一定的抗光解能力，其抗光解能力至少提高30%以上。而农药分子抗光解性能的提升，意味着其杀虫持效性的增加，也就是在同样杀虫效能下农药施用的减量。

图8 LC-BW制剂与LC-SC制剂抗光解性能曲线对比图

2.8 LC-BW制剂叶面接触角

叶面接触角是对农药制剂与植物叶面亲和力的一个量度，接触角越小，药剂喷施后在叶面的延展性就越好，药剂喷施后就不容易发生叶面滚落，进一步提高农药的有效利用率[20]。如图9所示，可以看到LC-BW制剂在水稻叶面上的接触角比水和LC-EC要小，对比LC-EC至少提高10%以上，在水稻叶面上的接触角为75.9±2.6 °，这大大提高了农药在水稻叶面上的附着力。而LC-BW制剂在玉米叶面上的接触角为38.2±2.3 °，与LC-SC相比，至少提高了30%，证明了LC-BW制剂在玉米叶面上的附着力非常强。

图9 LC-BW制剂与LC-EC制剂接触角的对比图

2.9 LC-BW制剂杀虫活性测试

2.9.1不同浓度的LC-BW制剂杀虫毒性

图10是LC-BW制剂与对照样LC-SC和LC-EC分别在浓度为450ppm,150ppm,50 ppm,16.7ppm和5.6ppm下48内对螟虫(3龄中末期)的致死率。可以看到在150ppm的浓度时，三者的杀虫效果没有显著的差异。在16.7ppm时，LC-SC的杀虫效果比LC-BW制剂要好一些，这是因为LC-BW制剂中的LC被蜂蜡包裹，不能全部释放导致最大毒性降低。

图10 不同浓度的LC-BW制剂与LC-SC、LC-EC杀虫活性

2.9.2 LC-SC制剂杀虫持效性测试

LC-BW制剂的杀虫活性与施药时间关系的结果见图11。可以看出100ppm的LC-BW制剂和对照样LC-EC和 LC-SC制剂在前15天的杀虫效果都保持在96%以上，但是到了20天的时候，LC-BW制剂的杀虫效果明显高于对照LC-EC和 LC-SC制剂。LC-BW制剂在20天内都可以保持97%以上的杀虫率，而且20天内的杀虫率基本稳定，但是对照LC-EC和 LC-SC制剂后期杀虫效率明显降低，这是因为经包封后，LC的稳定性得到了大大提高所致。

图11 LC-BW制剂与对照样20天对螟虫致死率对比图

3 结论

本研究以蜂蜡作为包裹基质，采用简单的高速乳化和超声分散工艺制备了一种三氟氯氰菊酯-蜂蜡纳米制剂，该制剂粒径范围为：100～250nm，具有抗光解和温度及pH控制释放的能力，其在保持与市场上售卖的三氟氯氰菊酯乳油和悬浮剂一样毒性的同时，增加了杀虫持效性。LC-BW制剂的主要溶剂是水，因此是一款高效环保型纳米农药制剂，可以进一步在大田害虫防治中推广。