维生素D受体基因多态性与昆明地区2型糖尿病伴骨质疏松症的关系

牛 玲 ，李博一 ，毛静秋 ，唐 艳 ，马 蓉 ，刘 方 ，张 程 ，韩竹君 ，苗翠娟 ，张 娴

（1）昆明市第一人民医院内分泌科；2）检验科，云南 昆明 650011）

糖尿病患者易同时合并骨质疏松症。由于骨质疏松导致的骨折和骨折致残严重影响患者生活，同时给家庭、社会带来沉重经济负担。因此重视防治糖尿病性骨质疏松对于提高糖尿病患者的生活质量具有重要意义。遗传是T2DM和OP重要的发病因素，有研究[1]认为糖尿病性骨质疏松是一种多基因遗传病，这些基因包括降钙素受体基因、维生素D受体（vitamin dreceptor，VDR）基因及护骨素基因等。目前，对VDR基因多态性与骨质疏松症的关系研究报道较多，但国内研究结果尚不完全一致。本研究旨在探讨VDR基因多态性与昆明地区T2DM伴骨质疏松症的关系，以期为昆明地区T2DM伴骨质疏松症防治提供理论依据，并早期防治糖尿病性骨质疏松，提高糖尿病患者的生活质量。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年6月至2019年1月在昆明市第一人民医院内分泌科住院治疗的2型糖尿病患者237例，其中男性122例，女性115例，年龄50～84岁，平均（64.68±7.92）岁。2型糖尿病诊断标准采用2013年版《中国2型糖尿病防治指南》标准诊断糖尿病[2]。骨质疏松症诊断标准采用2011年版《原发性骨质疏松症诊治指南》标准诊断[3]，按T值评分诊断骨质疏松。所有入选的2型糖尿病患者在昆明地区居住时间均大于10 a。排除标准：（1）1型糖尿病，继发性糖尿病；（2）各种糖尿病急性并发症、伴有感染、营养不良、严重心脑及肝肾疾病、肿瘤患者；（3）甲状腺手术史，合并其他可能引起甲状腺激素代谢异常的其他内分泌、免疫系统疾病、结缔组织病者，如垂体瘤、垂体功能减退者，亚急性甲状腺炎等；（4）皮肤疾病无法接受阳光照射者；（5）存在类风湿或风湿或关节炎，且应用激素类药物时间超过6个月，或曾经接受活性维生素D、降钙素、雌激素受体调节剂等影响骨代谢的药物治疗者；（6）存在畸形性骨关节炎者和成骨不全患者。纳入的研究对象均签署知情同意书，且本研究经昆明市第一人民医院医学伦理学委员会批准。

1.2 分组

（1）将237例患者按骨密度检测结果分为糖尿病无骨质疏松症61例；糖尿病合并骨量减少111例；糖尿病伴骨质疏松65例。

（2）将237例患者按VDR基因型分组为：BB组31例，占13.1%；Bb组184例，占77.6%，bb组22例，占9.3%。

1.3 研究方法

1.3.1 一般指标记录年龄、性别、糖尿病病程，男性是否吸烟，男性是否饮酒（注：所有女性患者均不吸烟，不饮酒）。测试当日由专人用固定体重/身高测量仪测定：体重、身高、计算体重指数（BMI），单位kg/m2。

1.3.2 血压指标采用汞柱式标准袖带血压表，休息5分钟后测定坐位右上臂收缩压（SBP）/舒张压（DBP），单位mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.3.3 其他生化指标受试者隔夜禁食8～12 h，清晨取静脉血测空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、肝肾功能电解质（血钙）、血脂、尿酸（UA）、维生素D浓度、雌激素水平、睾酮水平，超敏C反应蛋白（Hs-CRP）、纤维蛋白原（FIB）。按标准方法行OGTT试验，检测OGTT-0 h、2 h血糖，采用化学发光法测定0 h、2 h胰岛素（INS）水平（单位：mIU/L）。再采用稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：HOMA-IR=FINS X FPG/22.5，FINS单位为mIU/L，FPG即OGTT-0 h，单位为mmol/L。低的HOMA-IR示高胰岛素敏感性，而高的HOMA-IR表示胰岛素敏感性差，存在胰岛素抵抗。

1.3.4 外周血基因组DNA提取空腹采集静脉血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，标本收集结束后购进DNA提取试剂盒统一提取VDR基因。所需试剂及仪器为：DNA提取试剂盒，购于AXYGEN公司；DNA聚合酶（2×Taq Master Mix）购于Bioteke公司，引物由昆明硕擎公司合成；普通PCR仪购于美国应用生物系统公司（型号ABI2720）；各种规格的离心管、枪尖、PCR管、一次性乳胶手套和口罩购于NSET公司。

1.3.5 PCR扩增（1）扩增所使用的引物（Bsm I位点）：上游引物5′-GAACCAAGACTACAAGTACC GCGTCAGTGA-3′；下游引物5′-TGGCGGCAGCG GATGTACGTCTGC-3′；（2）PCR反应体系：25 μL混匀液体。包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，硕 擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，硕擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR反应条件：共35个循环，95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反应完成后，72 ℃再延伸10 min；（4）酶切鉴定基因型：PCR扩增产物用BsmⅠ酶酶切后，置于2%琼脂糖凝胶电泳确定基因型。

1.3.6 骨密度测量采用通用电气医疗系统（中国）有限公司生产的双能X线骨密度仪（型号DPX Bravo）测量腰椎L1～L4、股骨颈、髋部骨密度及T值评分（BMD），单位g/cm2。

1.4 统计学处理

本研究的所有数据均使用SPSS11.5软件包进行统计处理。采用Hardy-Weinberg平衡检测基因型的分布是否具有代表性。正态分布计量资料用均数±标准差（）表示，3个独立样本比较，采用方差分析，组间比较用最小有意义差异法（LSD检验）。非正态分布计量资料用（MP25，P75）表示，采用秩和检验。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素Logistic回归分析筛选独立危险因素。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组人群一般资料比较

3组人群一般资料比较，结果显示：3组患者性别、年龄、吸烟、饮酒、DBP、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮差异均有统计学意义（P＜0.05），且在T2DM伴骨质疏松组与无骨质疏松组比较时，上述指标均有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1 研究对象的一般资料比较[，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data of study subjects [，M（P25，P75）]

表1 研究对象的一般资料比较[，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data of study subjects [，M（P25，P75）]

总体比较：*P＜0.05，两两比较：与无骨质疏松组比较，#P＜0.005，；与合并骨量减少组比较，&P＜0.05。

2.2 VDR基因型及等位基因频率分布情况

2.2.1 VDR基因型酶切电泳图结果显示：VDR基因经Bsm I酶酶切后对应的基因型有3种：纯合子BB 型825 bp一条带；杂合子Bb 型825 bp、675 bp、150 bp三条带；纯合子bb 型675 bp、150 bp两条带，见图1。

图1 VDR基因型酶切电泳图Fig.1 VDR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.2 VDR基因型分布情况VDR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明所选人群代表性好.在237例人群中，VDR基因型分布情况为：BB型31例，占13.1%，Bb型184例，占77.6%，bb型22例，占9.3%。提示昆明地区糖尿病患者中，VDR基因型以Bb型为主。

2.2.3 3组人群VDR基因型分布频率比较结果显示：3组人群VDR基因型BB，Bb，bb基因型比较，无统计学差异（χ2=6.456，P=0.168），见表2。

表2 VDR基因型分布频率比较[n（%）]Tab.2 Comparison of VDR genotypes distribution frequency [n（%）]

2.2.4 3组人群VDR等位基因分布比较3组人群VDR等位基因B、b的分布频率无统计学差异（χ2=1.953，P=0.162），见表3。

表3 VDR等位基因分布频率比较Tab.3 VDR allele frequency distribution

2.2.5 VDR基因多态性与2型糖尿病患者BMD的关系结果显示：237例T2DM患者中，VDR不同基因型在各部位的BMD值差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 VDR基因多态性与2型糖尿病患者BMD的关系[（g/cm2），（）]Tab.4 The relationship between the VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

表4 VDR基因多态性与2型糖尿病患者BMD的关系[（g/cm2），（）]Tab.4 The relationship between the VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

2.3 多因素Logistic回归分析结果

将VDR基因型（1为BB型，2为Bb型，3为bb型）及单因素分析3组间具有统计学差异的变量，即性别（0为女，1为男）、年龄、吸烟（0为无，1为有）、饮酒（0为无，1为有）、DBP、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮作为因变量，糖尿病有无骨质疏松作为自变量（0为无，1为有），进行多因素Logistic回归分析，以筛选糖尿病伴骨质疏松的独立危险因素。结果显示：年龄（OR1.115、98%CI：1.035～1.202、P=0.004）、吸烟（OR10.318、95%CI：1.637～65.046、P=0.013）可以进入回归方程，见表5。

表5 Logistic回归分析结果Tab.5 Logistic analysis results

参考类别说明：“VDR基因型”中的BB型，“性别”以女性，“吸烟”以不吸烟，“饮酒”以不饮酒，“糖尿病有无骨质疏松”以糖尿病无骨质疏松作为参考类别。

3 讨论

糖尿病患者骨质疏松发病率明显升高[4]。国内有报道[5]，近1/3的糖尿病患者可诊断为骨质疏松症。然而，T2DM伴骨质疏松症的发病机制非常复杂，糖尿病高血糖状态、糖尿病慢性并发症、糖基化终末产物（AGEs）、氧化应激损伤、胰岛素及胰岛素样生长因子分泌的减少、炎症因子（CRP、IL-6等）水平的升高等均可能影响骨代谢[6-8]。另外，年龄、性别、吸烟、体重、生活方式、营养状态、环境和遗传等均是重要的影响因素。目前，对于VDR基因多态性与2型糖尿病伴骨质疏松症的研究，国内外已有不少报道，但结果多有不同。

本研究结果显示：从无骨质疏松症组-骨量减少组-骨质疏松症组，女性占比增多，分别是15例（24.6%），50例（45%），50例（76.9%）；而身高、体重、BMI逐渐下降，提示女性2型糖尿病患者更易患骨质疏松；而体重可能是2型糖尿病患者骨质疏松的保护性因素。但进一步Logstic回归分析显示：性别、身高、体重、BMI 均未进入回归方程，尚不能说明性别、体重是昆明地区T2DM伴骨质疏松的症的独立危险因素。

从无骨质疏松组-骨量减少组-骨质疏松症组，年龄逐渐增加，男性吸烟占比也增大，分别是24例（52.2%），32例（52.5%），11例（73.3%）。进一步Logstic回归分析显示：年龄、吸烟均进入回归方程，说明年龄、吸烟是昆明地区T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素，与曹国磊[9]的研究结果一致。有研究表明，长期吸烟可能导致镉在人体慢性蓄积，镉的蓄积可以加速骨量丢失，最终导致骨质疏松的发生发展[10-11]。

本研究还观察到，VDR（Bsm I）基因型分布频率为：BB型13.1%、Bb型77.6%，bb型9.3%，提示昆明地区T2DM患者VDR（Bsm I）基因型以Bb型为主。在T2DM伴骨质疏松患者中，VDR基因型分布频率为：BB型12.3%、Bb型75.4%，bb型12.3%，提示昆明地区T2DM伴骨质疏松患者VDR（Bsm I）基因型也以Bb型为主。这与北京[12]、广州[13]地区的研究结果不一致。这可能与VDR基因多态性在不同地域存在差异有关。

在2型糖尿病患者中，无骨质疏松组，骨量减少组，骨质疏松组3组比较，VDR基因型分布频率及等位基因频率均无统计学差异。梁伟对广州地区的汉族人群研究发现[13]：正常骨量组，骨质疏松组，2型糖尿病合并骨质疏松组比较，3种酶（Bsm I，Apa I，Taq I）定义的VDR基因型均无统计学差异，笔者的结果与之一致。国内张红红[14]的研究也认为VDR基因与骨质疏松无关。国外Lim等[15]对荷兰人群的研究发现VDR基因多态性与骨质疏松无关联。Hansen等[16]对丹麦绝经妇女的研究也认为VDR基因多态性不能预测该人群的骨密度及骨量丢失。进一步按VDR基因型分组比较发现，不同基因型间不同部位的骨密度数值也无统计学差异，提示VDR基因型可能不是T2DM患者骨密度降低的易感基因。将VDR基因型及单因素分析中具有统计学差异的变量作为因变量，糖尿病有无骨质疏松作为自变量，进行多因素Logistic回归分析发现，VDR基因型未进入回归方程，提示VDR基因型尚未增加T2DM人群患骨质疏松症的风险，VDR（Bsm I）基因型与昆明地区 T2DM伴骨质疏松症的遗传易感性无关。

综上所述，T2DM伴骨质疏松症的影响因素及相关候选基因较多，单一基因的作用是有限的，基因多态性在不同国家、种族、地域也存在较大差异。笔者的研究发现，年龄，吸烟是T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素，但未发现VDR（Bsm I）基因型与昆明地区 T2DM伴骨质疏松症的遗传易感性相关。有待进行更加广泛、深入、大样本、多种族、多地域、多个基因的联合研究，以为2型糖尿病骨质疏松的防治工作提供更多的信息和依据。