不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对牦牛瘤胃体外发酵的影响

夏洪泽, 黄文植, 张琳琳, 张晓涵, 崔占鸿, 刘书杰

(青海大学畜牧兽医科学院， 青海省牦牛工程技术研究中心， 青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室， 西宁 810016)

21世纪初,卢德勋结合我国的饲草产量以及供给现状，提出粗饲料分级指数(grading index，GI)概念，并将其引入饲草品质评价体系[1-2]。研究人员对GI模型进行了验证、对比和改进，得出GI与饲料相对值(relative feed value，RFV)分级的顺序性、准确性较为一致，表明GI可应用于饲粮中粗饲料组合的优化，作为评定粗饲料品质的依据[1-4]。研究表明，利用GI模型进行动物试验，通过GI优化粗饲料组合的搭配，以达到同等条件下高精粗比饲粮营养调控作用，高GI条件下，干物质和中性洗涤纤维的表观消化率较高，瘤胃降解纤维能力增强，乙酸较稳定，丙酸浓度升高，纤维含量越低或者蛋白含量越高，养分表观消化率越高，GI值越高，粗饲料品质越好[2,5-7]。

牦牛作为青藏高原地区的特有畜种，主要以放牧形式养殖，但由于青藏地区冷季到来较早、时间相对较长，草地牧草产量相对较低，营养价值变化相对较大，由此，草畜冲突较为明显，冷季反刍家畜自身的营养需要量难以得到满足，致使家畜体况降低、甚至死亡[8-9]。近年，牦牛养殖已逐渐向适时适度规模舍饲转型。在舍饲养殖过程中，燕麦干草作为优质禾本科牧草已被广泛应用于牦牛生产。有报道指出，经典的粗饲料搭配为豆科牧草与禾本科牧草组合[10-13]。但将GI应用于牦牛粗饲料组合优化的研究尚未见报道，因此，本研究以青藏地区畜牧养殖中常用的燕麦干草、苜蓿干草为材料，将2种饲草按不同比例混合，结合GI体系，采用人工瘤胃法研究不同饲草组合在牦牛瘤胃中动态发酵规律，筛选出苜蓿干草-燕麦干草组合的最佳GI，充分发挥两种饲草间的正组合效应，为提高粗饲料合理搭配、精饲料合理使用提供参考，为提高舍饲牦牛的生产性能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地点及材料

试验地点位于青海大学畜牧兽医科学院(E101°49′17″，N36°34′3″)，平均海拔2 261 m，属大陆性高原半干旱气候。其特点是：气压低、太阳辐射强，昼夜温差大。苜蓿干草(alfalfa hay，AH)、燕麦干草(oat hay，OH)采集于湟中丰泰种养殖专业合作社，两种牧草经鼓风干燥箱(65 ℃)干燥制成风干样，剪短后粉碎，过 20目筛，密封保存待测。2种粗饲料原样中粗蛋白质(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、代谢能(gross energy，GE)、钙和磷含量详见表1。本试验的瘤胃液供体为3头装有瘤胃瘘管、体重(280.5±15.0)kg的大通牦牛，饲喂方式为自由采食、饮水，每日饲喂2次。饲喂日粮的成分和营养水平详见表2。

表1 苜蓿干草和燕麦干草的营养水平(干物质基础)Table 1 Nutrient levels of alfalfa hay and oat hay (dry material basis)

表2 日粮组成及其营养水平(干物质基础)Table 2 Composition and nutrient levels of the diet (dry material basis)

1.2 试验设计

将苜蓿干草与燕麦干草分别按照7∶3、6∶4、5∶5、4∶6和3∶7的质量比进行组合，参照胡红莲等[14]GI的计算方法，即制成GI为7.24、6.40、5.56、4.72、3.88的苜蓿干草-燕麦干草组合，分别进行牦牛瘤胃体外发酵试验，设置发酵3、6、12、24和48 h，每个样本设3个重复，且进行两次重复试验。

1.2.1样本制备及瘤胃液的配置 称取预制比例的苜蓿干草与燕麦干草组合样品(400±5)mg装入自制尼龙袋，待用。将装好样品的尼龙袋放入100 mL的发酵管内，为保证发酵管气密性，在其内塞上均匀涂抹适量工业凡士林。每个样本设3个重复，每次试验设置3个空白对照。采用Menke等[15]的方法准备人工瘤胃营养液。于晨饲前，通过瘤胃瘘管，每头牦牛各抽取1 000 mL瘤胃液，充分混匀。在通入CO2的前提下，将抽取的瘤胃液与人工瘤胃营养液以2∶1的体积比混合后，每个培养管加入(40.0±0.5)mL混合营养液。排空培养管内气体，并记录起始刻度值后，将培养管立即转入已预热的恒温(39℃)自动震荡的人工瘤胃装置中进行培养。

1.2.2发酵底物、发酵液的收集 分别在发酵3、6、12、24 和48 h时停止培养，将培养管中装有发酵底物的尼龙袋取出投入冰水中以终止反应，并用蒸馏水冲洗尼龙袋，直至无色后， 65 ℃烘干，备用；将发酵液收集于15 mL离心管，置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

1.3 体外发酵指标测定

1.3.1累积产气量(gas production，GP)及产气参数的测定 参照夏洪泽等[16]方法测定累积产气量(GP)的，分别在发酵0、3、6、12、24 和48 h取出培养管并记录刻度值；利用 SAS 9.0 软件，根据Ørskov等[17]的产气模型计算各处理体外产气参数和累积产气量。

GP=b(l-e-ct)

(1)

式中，b代表潜在产气量(mL)；t代表发酵开始后某一时间(h)；c代表 b 的产气速率常数(%·h-1)。

某一时间段累积产气量(mL)=本时间段内累积产气量-本时间段内空白管产气量

(2)

1.3.2干物质降解率、中性洗涤纤维降解率及pH的测定 采用台式酸度计(HANNA HI221型)测定发酵液pH。将发酵底物置于65 ℃烘箱中烘6 h，烘3次至恒重测定底物质量[18]，计算干物质降解率(dry matter disappearance in vitro，DMDIV)和中性洗涤纤维降解率(Neutral detergent fiber degradation in vitro，NDFDIV)。

干物质降解率=(底物质量-残留底物质量) /底物质量×100%

(3)

中性洗涤纤维降解率=(底物NDF-残留底物NDF)/底物NDF×100%

(4)

1.3.3氨态氮和微生物蛋白测定 通过比色法[19]利用紫外可见分光光度计(波长：625 nm)测定吸光值，通过标准曲线得出发酵液的氨态氮(ammonia nitrogen，NH3-N)浓度。微生物蛋白(microbial protein，MCP)的测定依据Cotta等[20]差速离心法，对菌体蛋白进行分离，将分离出的菌体蛋白转移至消化管中，用考马斯亮蓝法进行测定。

1.3.4挥发性脂肪酸和甲烷的测定 挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)和甲烷(CH4)的测定采用气相色谱仪(日本岛津 GC-2014)进行测定[21-22]。其中，VFAs测定的气相色谱条件为：载气N2，分流比40∶1，进样量1 μL，进样孔温度250 ℃，辅助箱温度250 ℃，气化室温度250 ℃，FID检测器温度250 ℃，色谱柱型号为AT-FFAP 毛细管填充柱(30.0 m×0.32 μm)。恒流模式：流量 2.1 mL·min-1，平均线速度 38 cm·s-1，柱压 11.3 psi(0.1 Mpa)。柱温箱程序：10 ℃·min-1升温至90 ℃，1 min；10 ℃·min-1升温至120℃，1 min；10 ℃·min-1升温至150 ℃，3 min。CH4测定的气相色谱条件为：载气N2(40 mL ·min-1)，进样量100 μL，进样口温度60 ℃，柱温50 ℃，TCD 检测器温度100 ℃，热丝温度150 ℃。甲烷计算公式如下。

甲烷产量(mL)=总产气量×甲烷所占百分比

(5)

1.3.5组合效应指数的计算 单项组合效应值(single actors associative effects index，SFAEI)和综合组合效应指数(multiply factors associative effects index，MFAEI)的计算参照王旭等[1]方法。

SFAEI= [组合后某参数实测值-(组分一实测值×其所占比例+组分二实测值×其所占比例)]/ (组分一实测值×其所占比例+组分二实测值×其所占比例)

(6)

MFAEI=∑SFAEI

(7)

1.4 数据处理与分析

利用Excel 2016进行数据的整理和分析，采用SPSS 20.0软件进行单因素ANOVA分析，采用 Duncan 氏 SSR法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对累积产气量的影响

各GI组合的GP随着培养时间延长而增加；各时间段的GP和潜在产气量(b)随着GI降低呈先升高后降低的趋势，且GI=6.40组合的产气量高于其他GI组合(表3)。发酵3、6和12 h，GI=6.40组合与GI=7.24组合间累积产气量差异不显著，但均显著高于其他组合；发酵24 和48 h，GI=6.40组合的产气量显著高于其他组合。

表3 各时间段不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的累积产气量Table 3 GP of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time

2.2 不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对干物质降解率、中性洗涤纤维降解率的影响

发酵3～12 h，DMDIV随着GI降低呈减小趋势；发酵24和48 h，DMDIV随着GI减小呈先增加后降低的趋势，且在GI=6.40时达到最大值(表4)。发酵3 h，GI=6.40组合DMDIV最高，与GI=7.24、5.56组合间差异不显著，但显著高于GI=4.72、3.88组合。发酵12 h，GI=7.24组合DMDIV最高，与GI=6.40、5.56组合间差异不显著，但显著高于GI=4.72、3.88组合。发酵24 h，GI=6.40组合与GI=7.24组合的DMDIV差异不显著，但显著高于其他组合。发酵48 h，GI=6.40组合与GI=7.24、5.56、4.72组合的DMDIV差异不显著，但显著高于GI=3.88组合。

表4 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的干物质降解率Table 4 DMDIV of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (%)

NDFDIV随着GI降低呈先升高后降低的趋势，但 GI=6.40组合的NDFDIV均高于其他GI组合(表5)。发酵3 h，GI=6.40组合的NDFDIV与GI=7.24、5.56、4.72组合间差异不显著，但显著高于GI=3.88组合。发酵6 h，GI=6.40组合的NDFDIV与GI=7.24、5.56组合间差异不显著，但显著高于GI=4.72、3.88组合。发酵48 h，GI=6.40组合的NDFDIV与GI=7.24、5.56、4.72组合间差异不显著，但显著高于GI=3.88组合。

表5 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的中性洗涤纤维降解率Table 5 NDFDIV of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (%)

2.3 不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对发酵液氨态氮、微生物蛋白和pH的影响

各时间段的NH3-N浓度均随着GI减小呈先增加后降低的趋势(表6)。发酵3～12 h，GI=6.40组合的NH3-N浓度与GI=5.56组合差异不显著，但显著高于其他组合。发酵24 h，GI=6.40组合的NH3-N浓度最高，显著高于其他GI组合。发酵48 h，GI=6.40组合的NH3-N浓度与GI=7.24组合间差异不显著，但显著高于其他GI组合。

各时间段的MCP浓度随着GI降低呈现出先增加后降低的趋势，且在GI=6.40时达到最大值(表7)。发酵3 h，GI=6.40组合与GI=7.24组合的MCP浓度较高，且两者间无显著差异，但均显著高于其他组合。发酵6 h，GI=6.40组合与GI=7.24、5.56组合的MCP浓度差异不显著，但显著高于GI=4.72、3.88组合。发酵12和24 h，GI=6.40组合与GI=7.24、5.56、4.72组合的MCP浓度差异不显著，但显著高于GI=3.88组合。发酵48 h，GI=6.40组合与GI=7.24组合的MCP浓度差异不显著，但显著高于GI=5.56、4.72、3.88组合。

表7 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的MCP浓度Table 7 MCP concentration different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mg·L-1)

各时间段发酵液pH随着GI降低呈上升趋势(表8)。发酵3～6 h，GI=6.43组合的pH与GI=7.24、5.56、4.72组合差异不显著，但均显著低于GI=3.88的组合。发酵12～24 h，各组合发酵液的pH均无显著差异。发酵48 h，GI=6.40组合的pH与GI=7.24、5.56组合间差异不显著，但均显著低于GI=4.72、3.88组合。

表8 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的pH Table 8 pH of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time

2.4 各时间段不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对发酵液中挥发性脂肪酸含量的影响

随着GI减小，不同发酵时长发酵液中乙酸浓度均呈现出先升高后降低趋势，且GI=6.40组合的乙酸浓度最高(表9)。发酵3～6 h，GI=6.40组合的乙酸浓度显著高于其他GI组合。发酵12～48 h，各组合发酵液的乙酸浓度均无显著差异。

表9 不同燕麦干草-苜蓿干草组合的乙酸浓度Table 9 Acetic acid of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mmol·L-1)

随着GI减小，不同发酵时长的发酵液中丙酸浓度均呈现出先增加后降低的趋势，且GI=6.40组合的丙酸浓度最高(表10)。发酵3 和12 h，GI=6.40组合的丙酸浓度显著高于其他GI组合。发酵6 和48 h，GI=6.40组合的丙酸浓度与GI=7.24、5.56组合间差异不显著，但显著高于GI=4.72、3.88组合。

表10 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的丙酸浓度Table 10 Propionic acid of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mmol·L-1)

随着GI减小，不同发酵时长的发酵液中总挥发性脂肪酸浓度呈先升高后降低的趋势，且GI=6.40组合的总挥发性脂肪酸浓度最高(表11)。发酵3 h，GI=6.40组合的总挥发性脂肪酸浓度显著高于其他GI组合。发酵6 h，GI=6.40组合的总挥发性脂肪酸浓度与GI=7.24组合差异不显著，但显著高于其他GI的组合。发酵12～48 h，GI=6.40组合的总挥发性脂肪酸浓度与GI=7.24、5.56组合差异不显著，但显著高于其他GI组合。

表11 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的总挥发性脂肪酸浓度Table 11 Total VFAs of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mmol·L-1)

2.5 不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对甲烷产量的影响

CH4含量随着GI减小呈现出先升高后降低的趋势，且GI=6.40组合的CH4含量最高(表12)。发酵3 h，GI=6.40组合的CH4含量显著高于其他组合。发酵6和12 h，不同GI组合的CH4含量均无显著差异。发酵24 和48 h，GI=6.40组合的CH4含量与GI=7.24、5.56、4.72组合差异不显著，但均显著高于GI=3.88组合。

表12 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的甲烷产量Table 12 CH4 of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time (mL·mg-1)

2.6 不同分级指数燕麦干草-苜蓿干草组合对综合组合效应指数的影响

发酵3～48 h，MFAEI均随着GI降低呈现出先增大后减小的趋势，且GI=6.40组合的MFAEI均高于其他GI组合(表13)。其中，GI=7.24组合在发酵24和48 h时产生了正组合效应；GI=6.40、5.56组合在发酵3～48 h时均产生了正组合效应；GI=4.72组合在发酵24和48 h时产生了正组合效应；GI=3.88组合在发酵3～48 h时均为负组合效应。

表13 不同GI燕麦干草-苜蓿干草组合的综合组合效应指数 Table 13 MFAEI of different GI with OH-AH proportions at different fermentation time

3 讨论

产气量作为一个综合反映底物发酵程度的重要指标，同时也表现出了瘤胃微生物的活跃程度。产气量的多少反映了燕麦干草-苜蓿干草组合的可消化性[16]。本研究中不同GI组合的GP均随培养时间延长而增加，说明体外发酵处于正常状态。GP与DMDIV呈正相关，且不同发酵时长的GP、潜在产气量、DMDIV、NDFDIV均随着GI减小呈现先升高后降低的趋势，说明通过苜蓿干草与燕麦干草组合，高蛋白质的苜蓿干草可显著改善燕麦干草的发酵程度，促进纤维物质的消化，但GI=7.24组合的DMDIV、NDFDIV低于GI=6.40组合，说明苜蓿干草虽能提高燕麦干草的消化率但也有限度，这与Silva等[23]研究结果一致。

本研究发现，CH4占总产气量的比例相对稳定，气体中各成分含量相对降低，但气体占总产气量的相对比例变化较小，这与Nagaraja等[24]研究结果相一致。冯仰廉等[25]指出瘤胃发酵中性洗涤纤维对甲烷影响较大。而本研究中不同GI组合日粮的 NDFDIV与甲烷产量趋势较为一致，这可能是由于不同GI组合的中性洗涤纤维含量不同，对产甲烷菌的生长繁殖有一定影响。因此，GI=6.40粗饲料组合的甲烷产量最高，也可能是其中的纤维在瘤胃内降解加快，导致甲烷产量增多，这一结果与王增林等[26]和郑文思等[27]结论相似。

MCP 可为反刍动物瘤胃氮的主要来源，且NH3-N浓度又是影响MCP合成的重要因素。若NH3-N浓度过高会浪费营养源，过低会降低瘤胃微生物活性[28-29]。前人研究表明，MCP合成所需的NH3-N浓度为3.5～290 mg·L-1[30-32]。本研究中各GI指数组合的NH3-N浓度均在105.9～262.0 mg·L-1，可为微生物提供充足氮源以合成MCP。20～50 mg·L-1就可满足细菌对纤维降解的需求，GI=6.40组合的NH3-N和MCP浓度均最高，且中性洗涤纤维降解率也高于其他组合，可能是由于GI=6.40组合给予了瘤胃微生物更加适合的生长环境，因此，对饲料组合的降解也更加充分，从而使这一组合的NH3-N、MCP浓度均高于其他组合。

pH高低是牦牛瘤胃发酵功能、内环境稳态、有机酸生成以及微生物活性的最直接表现[33]。研究显示，反刍动物瘤胃液pH正常变动范围为6.0～7.5[34-36]。本研究各GI组合的pH均在正常范围内，且pH与VFAs浓度呈负相关。其中GI=6.40组合的pH低于其他组合，可能是由于底物发酵充分，VFAs产量高，从而导致pH较低。VFAs可为机体提供大量的能量[37-38]，其中乙酸、丙酸和丁酸占VFAs含量的95%左右，且乙酸约占VFAs产量的70%～75%[39-40]。VFAs不仅是反刍动物能量代谢的表现形式，还具有许多调节功能，如乙酸有利于提高动物的体脂率，丙酸有利于葡萄糖的转化和储存[41]。本研究中，乙酸、丙酸等VFAs浓度随着GI减小呈先增加后减小的趋势，可能是由于发酵底物中的燕麦干草富含纤维素，随着GI指数的改变，燕麦干草比例增加，纤维素含量增加，微生物可利用的纤维素增多，产生的挥发性脂肪酸增多，与前人研究结果相一致[42-44]。当燕麦干草达到一定量时，继续增加则不利于瘤胃发酵，与李明超[45]研究结果一致。由此表明，通过粗饲料合理搭配有利于提高粗饲料中干物质的降解率，提高利用率。

王旭[1]以GI和MFAEI为依据，对不同种类饲草进行配比组合，最大程度地发挥粗饲料间的正组合效应，从而降低精料的比例，既保证了动物的生产性能，又提高了养殖效益。张吉鹍[46]研究表明，牧草比例不同，营养组成不同，进而影响了整体发酵程度，改变了饲料的利用率。因此，本研究也利用 MFAEI参数，将各项指标综合起来，研究燕麦干草和苜蓿干草不同配比的组合效应，各GI组合的MFAEI随着发酵时间的延长逐渐增大；且随着GI的减小呈现出先增大后减小的趋势，即随着苜蓿干草比例的减少，MFAEI先升高后降低。由此表明，苜蓿干草和燕麦干草组合可以产生组合效应，但需比例适当，若燕麦干草比例过高会使组合的可发酵程度降低，MFAEI随之减小，直至产生负组合效应。