工业大麻发育早期雌雄株鉴定方法的研究

孙哲王金娥乔永刚

(1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.灵石县农业农村局，山西 灵石 031300)

大麻(Cannabis Sativa L.)是桑科(Moraceae)大麻属(Cannabis)一年生直立草本植物[1]，为雌雄异株异花授粉植株。大麻起源于中国，是地球上最古老的作物之一，栽培历史超过一万年[2]，其中工业大麻又名汉麻，是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻品种[3]。大麻种子富含优质蛋白质和不饱和脂肪酸，具有降压调脂、改善消化系统等功效[4]；其茎秆所含的大麻纤维具有吸湿、散湿、透气等特点，是很好的纺织、造纸和建筑原材料[5]；其花、叶中的活性物质广泛应用于医药和化妆品领域[6]。

工业大麻植株多为雌雄异株，偶有雌雄同株现象，雌雄株比例一般为1∶1，但外界环境条件会影响雌雄株比例[7]。工业大麻的雌雄株有各自的特点，一般来说，工业大麻雄株的纤维质量高于雌株，雌株可以收获种子。但是，目前尚无准确鉴定工业大麻种子和幼苗期性别的方法，且工业大麻的性别表达受多种因素影响，如温度、光周期、激素、重金属盐等都能诱导大麻性别表达[8]。

工业大麻早期性别鉴定的方法主要有性状鉴定和分子鉴定，在工业大麻性别分化研究中，《齐民要术》等古书籍记载，颜色较黑、籽粒饱满的种子多为雌麻；颜色较浅，粒重较轻的种子多为雄麻[9]。王殿奎[10]等提出,工业大麻植株在10cm左右时，会出现紫心紫茎植株，为花麻，即雄麻。彭子模[11]等人的研究显示，工业大麻幼苗提取液在甲基红染色后水浴20～23h后颜色会发生明显差异，混合液呈黄褐色的为雄性，呈黄绿色的为雌性。姜颖[12]等人筛选出1条大小为869bp的工业大麻雄性特异性序列。

根据不同的生产目标需要合理配置雌雄株，在种子和幼苗期对大麻植株进行性别鉴定是必要的，为探索一种简单易行的工业大麻发育早期雌雄株鉴定方法，本试验利用雄株特异性序列、种子特征性状、苗期性状对工业大麻雌雄株进行鉴定与研究，以期得到在种子和苗期判断工业大麻性别的方法，为工业大麻的农业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用工业大麻材料来自20个不同产地，经山西农业大学乔永刚副教授鉴定，均种植于太谷区申奉村试验田，见表1。随机均匀选取各产地的工业大麻雌雄株叶片适量，用酒精擦拭后装于自封袋中，于-80℃保存备用。另随机选取DM19幼苗和种子若干，分别用于紫心紫茎幼苗鉴定、甲基红染色鉴定、种子形态鉴定试验和DNA提取。

表1 工业大麻种质资源产地信息

1.2 试验方法

1.2.1 工业大麻植株的分子鉴定

取20个产地的已知性别的工业大麻叶片利用改良CTAB法提取样本基因组DNA，使用Nanodrop 2000c测定DNA浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，并于4℃保存备用。所选的工业大麻雄性特异性序列引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，信息见表2。PCR扩增反应体系(10μL)及扩增程序信息见表3。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像仪检测。20个产地工业大麻雄株进行单株鉴定，每个产地雄株单独鉴定10株，20个产地工业大麻雌株进行混样鉴定。

表2 工业大麻雄性特异性序列引物信息

表3 PCR扩增反应体系及扩增程序

1.2.2 工业大麻种子形态观察与分子鉴定

选取DM19工业大麻种子，称重并描述种子形态，按重量与颜色对种子进行分类后利用1.2.1分子鉴定方法进行性别鉴定。

1.2.3 工业大麻幼苗外观形态观察与分子鉴定

选取DM19工业大麻紫心紫茎与绿心绿茎幼苗观察记录，并选用20株紫心紫茎工业大麻幼苗进行分子鉴定。

1.2.4 工业大麻幼苗甲基红染色与分子鉴定

随机选取DM19工业大麻幼苗30株，分别取叶片各0.1g，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，室温浸提1h后，4000r·min-1离心5min，取上清液1mL，加入2mL配好的甲基红染料，水浴20h后观察颜色并记录[11]，同时对所有植株进行分子鉴定。

2 结果与分析

2.1 工业大麻雄性特异性引物的验证

本试验所用基因组DNA的A260/A280值均在1.7～2.0，A260/A230值均>2.0，说明提取的DNA纯度较高，无蛋白质和无机盐污染。利用姜颖[12]等人研究的雄性特异性序列对20个产地的工业大麻雌雄株进行验证,结果如图1所示，所有雄性植株叶片材料在869bp处均出现特异性条带，雌株混池H1、H2未出现特异性条带，与预期结果一致，说明此引物可以用于鉴定工业大麻雌雄株。

2.2 工业大麻种子对雄性特异性引物的验证

为验证雄性特异性序列是否可以鉴定种子雌雄，随机取10粒工业大麻种子，利用OPV-08引物进行分子鉴定，结果如图2所示，Z2、Z3、Z5、Z8、Z9在869bp处出现特异性条带，为雄性种子，其余未出现条带，为雌性种子，说明该方法可以用于鉴定工业大麻种子雌雄。

图2 工业大麻种子对雄性特异性引物的验证

2.3 种子形态特征与性别鉴定

为验证种子形态鉴定工业大麻雌雄的准确性，对DM19工业大麻种子称量及观测后，可以将种子分为6类，如表4、图3所示。每类种子各取10粒提取单粒种子DNA，以OPV-08为引物进行分子鉴定。结果如图4所示，DS种子中有5粒出现特异性条带，XS种子中有7粒出现特异性条带；DQ种子中有1粒出现特异性条带，XQ种子中有3粒出现特异性条带；DB种子中4粒出现特异性条带，XB种子中有2粒出现特异性条带，为雄性工业大麻种子。

图3 工业大麻种子形态分类

图4 不同类型工业大麻种子分子鉴定结果

表4 工业大麻种子形态特征信息

2.4 工业大麻幼苗紫心紫茎与性别鉴定

为验证紫心紫茎工业大麻是否全为雄株，对采挖的20株紫心紫茎的工业大麻植株进行观察，并提取叶片DNA，以OPV-08为引物进行分子鉴定。紫心紫茎工业大麻以及绿心绿茎工业大麻幼苗的颜色对比见图5，分子鉴定结果显示，20株紫心紫茎大麻中有11株出现特异性条带，为雄性工业大麻，见图6。

图5 工业大麻幼苗紫心紫茎与绿心绿茎特征示意图

图6 紫心紫茎工业大麻植株分子鉴定结果

2.5 工业大麻甲基红染色特征与性别鉴定

为验证甲基红染色鉴定雌雄株的可行性，对选取的DM19的30株工业大麻幼苗进行染色试验，结果显示，32℃水浴20h后，混合液出现2种不同颜色，其中13个为紫红色，17个为黄褐色，如图7所示。对其叶片提取DNA，以OPV-08为引物进行分子鉴定。结果显示，13个呈紫红色的样本中有5个出现特异性条带，17个呈黄褐色样本中有8个出现特异性条带，验证为雄株。测量32℃水浴20h后混合液的pH值，结果如表5所示。

图7 工业大麻幼苗甲基红鉴定结果示意图

表5 工业大麻甲基红染色前后pH值

3 讨论与结论

大麻早期性别鉴定的方法有许多种，主要分为性状鉴定和分子鉴定，性状鉴定分为种子鉴定和苗期鉴定，多为经验鉴定。分子鉴定是利用特异性引物进行标记的一种方法，Mandolino等[13]利用RAPD技术从大麻中获得1个400bp与雄性表型相关的标记。Shao等[14]利用15个RAPD随机引物进行扩增，引物OPA-04和OPF-05扩增得到3个雌性相关片段。李仕金等[15]利用200条RAPD随机引物进行扩增，引物S208扩增得到1条大小为429bp与大麻雄性相关的特异条带。吕佳淑等[16]利用AFLP分子标记发现了1条348bp的大麻性别连锁雄性特异条带。郭丽等[17]获得了大麻雄性连锁AFLP片段，大小为734bp。陈其军等[18]利用S401引物扩增得到长度约为2.5kb的雄性相关片段。

本试验用20个不同产地的已知雌雄的工业大麻叶片对姜颖等[12]开发的RAPD工业大麻雄性特异性引物进行验证，结果显示，雄性叶片均在869bp处出现特异性条带，雌性叶片混池均未出现特异性条带，与预期结果一致，说明此引物可以用来鉴定工业大麻雌雄株。对于工业大麻种子雌雄的鉴定，前人多是通过种子外观形态进行鉴定，未曾用分子标记的方法鉴定过大麻种子雌雄。本试验通过提取单粒大麻种子基因组DNA，利用特异性引物OPV-08进行分子鉴定，在869bp处出现特异性条带，说明可以通过分子标记的方法鉴定出种子雌雄。

种子形态验证时，按照种子外观形态，将种子分为6类，古籍描述的种皮颜色较黑、籽粒饱满的种子多为雌麻，颜色较浅，粒重较轻的种子多为雄麻。本试验通过人眼识别出的外观形态可能有所差别，也有可能生长后期会出现性别诱导，导致试验结果与预期结果不一致。种皮带斑与否为种子外观形态的明显性状，通过验证也无法鉴定出种子雌雄。与宋湛江[19]在《我国古代的大麻生产》提到的“古代这种说法有矛盾，因为如单种白麻子或斑黑麻子,都无法繁殖后代。再说现在大麻也有灰白、斑黑和其他颜色的种子，而在生产上也未有能根据种子颜色不同而区别性别的方法”的结果相一致。

紫心紫茎的大麻验证结果显示，有11株紫心紫茎工业大麻为雄性，与紫心紫茎工业大麻全部为雄株的预期结果不符。甲基红染色试验结果显示，染色后混合液32℃水浴20h后，出现紫红色和黄褐色2种颜色，测试其pH值后，与甲基红的变色范围值一致[20]，但是2种颜色中均存在雌性和雄性，与雄性植株为黄褐色，雌性植株为黄绿色的预期结果不一致。

这些试验结果均表明，前人仅从种子以及幼苗外观、颜色等形态特征对工业大麻雌雄进行鉴定的方法不可靠，工业大麻雄性特异性序列可以准确鉴定出大麻种子和叶片的雌雄。