PD-1/PD-L1 在胃癌组织中的表达及其临床意义

邓 渊，马云涛

（1.甘肃省人民医院普外一科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学甘肃省中医药研究中心，甘肃 兰州 730000）

胃癌（gastric cancer）是一种起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国的发病率居各类肿瘤首位。大部分患者胃癌发现时已经到中晚期，严重影响患者的生命健康，因此急需寻找一种新的诊疗方案。随着对胃癌的深入研究，发现免疫逃逸在胃癌的发生、发展中扮演了非常重要的角色。PD-1 和其配体PD-L1 通路是抑制性免疫检查点，通过抑制T 细胞的免疫反应，在免疫耐受中发挥重要作用，从而造成肿瘤细胞免疫逃逸，这也为胃癌的诊疗提供了一种新的思路。本研究拟通过检测PD-1、PD-L1 蛋白在胃癌及癌旁标本中的表达，探讨PD-1、PD-L1 在临床中的诊疗意义，为胃癌的诊疗工作提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年1 月～12 月甘肃省人民医院收治的46 例实施胃癌根治术的胃癌患者作为研究对象，其中男性33 例，女性13 例；年龄35～81岁，平均年龄（58.70±9.05）岁；肿瘤直径：≤5 cm 39例，＞5 cm 7 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期19 例，Ⅲ～Ⅳ期27 例；分化程度：低分化26 例，中分化18 例，高分化2 例；浸润分布情况：粘膜及粘膜下层3 例，肌层21 例，浆层22 例；有淋巴结转移29 例，无淋巴结转移17 例。纳入标准：①经病理检查等确诊为胃癌者；②术前未行放化疗等抗肿瘤治疗者；③未合并其他恶性肿瘤者；④病历资料完整者。排除标准：①合并严重慢性病患者；②胃癌复发患者。本研究经医院伦理委员会审批通过，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂 鼠抗PD-1 和兔抗PD-L1 购于福州迈新生物技术有限公司，小鼠抗β-actin 单抗、二抗、DAB 试剂盒、枸橼酸缓冲液购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SP 免疫组化法检测胃癌及癌旁组织中PD-1、PD-L1 的表达情况 取胃癌患者的胃癌及其旁组织，经4%甲醛固定后制作蜡块待用。将组织以4 μm连续切片，常规脱蜡至水，经抗原修复、灭活内源性过氧化物酶、阻断非特异性反应后，加入PD-1、PDL1 一抗（稀释比例均为1∶100）后4 ℃孵育过夜，生物素标记二抗孵育后，滴加DAB 显色剂显色，苏木素复染，脱水透明封片。免疫组化结果判定[1]：每张切片中选取癌细胞数较多的5 个高倍视野（400×），每个视野计数100 个细胞。按染色强度计分：无阳性着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；按阳性细胞百分比计分：阳性细胞数＜5%为0 分，6%～30%为1 分，31%～60%为2 分，＞60%为3 分，将两项得分相加，≥2 分为阳性，＜2 分为阴性。

1.3.2 免疫印迹法检测胃癌及癌旁组织中PD-1、PD-L1 的表达情况 取胃癌及癌旁组织，经RIPA裂解，4 ℃，15000 r/min 离心10 min，取上清，测蛋白浓度，计算上样量。经10% SDS-PAGE 电泳后，电转至0.22 mm 的PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。封闭后加入相应浓度的PD-1、PD-L1 抗体，37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜；用TBST（TBS 加0.1%吐温）洗涤PVDF 膜3 次，10 min/次，后加入二抗，置于摇床37 ℃孵育1 h。用TBST 洗膜3 次，常规曝光显影。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，计数资料以（n）和（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1、PD-L1 表达与患者临床病理特征的关系SP 免疫组化检测结果显示，46 例患者胃癌组织中PD-1 蛋白表达阳性率为78.26%（36/46），高于PDL1 的58.70%（27/46），差异有统计学意义（χ2=4.079，P＜0.05），见图1。不同TNM 分期PD-1 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、肿瘤直径大小、分化程度、浸润分布情况、淋巴结转移PD-1表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同肿瘤浸润情况PD-L1 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、TNM 分期、淋巴结转移间PD-L1 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图1 PD-1 和PD-L1 在胃癌及癌旁组织中的表达(SP 免疫组化法×400)

表1 胃癌组织中PD-1 和PD-L1 蛋白的表达与临床病理特征的关系（n）

表1（续）

2.2 WB 法检测PD-1 和PD-L1 在胃癌组织中的表达 WB 法检测显示，在胃癌细胞中PD-1 和PD-L1均有表达，见图2。

图2 PD-1 和PD-L1 在胃癌及癌旁组织中的表达

3 讨论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，据报道[2，3]，我国的胃癌发病率最高，胃癌患病人数约占到了全世界的1/3，其中西北地区边远农村的胃癌发病率及死亡率居全国之首。胃癌的发病死亡率较高，5 年生存率不足40%，这主要就是因为许多患者发现胃癌时多数已是晚期，早期胃癌的检出率不到10%；如果患者能在胃癌仅限于胃壁的黏膜层时检出并进行治疗，5 年的生存率可达95%，因此早期发现并及时治疗对改善胃癌患者预后具有重要意义[4，5]，因此急需寻求高度特异性、高度灵敏的胃癌诊断标志物。

PD-1 是CD28 免疫球蛋白超家族中的一名成员，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1 主要表达于T 细胞、B 细胞及NK 细胞的表面，在维持淋巴细胞稳态方面起关键作用[6]。PD-L1 是PD-1 的配体，是B7 家族中的成员之一，由IgC 型胞外结构域、跨膜区及一个短胞质区尾部组成，主要表达于成熟的巨噬细胞、T 细胞、树突细胞、单核细胞等[7]。正常情况下，PD-L1 与PD-1 结合后，通过调控T 细胞的增殖与活化，抑制淋巴细胞增殖并诱导其凋亡，从而在自身免疫疾病中发挥重要作用[8]。

肿瘤的发生发展与人体的免疫功能密切相关，正常情况下，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些“非己”细胞，抵御肿瘤的发生发展。但是在某些情况下，肿瘤细胞能通过多种机制逃避机体免疫系统的识别，在体内迅速增殖，即肿瘤免疫逃逸机制[9]。研究表明[10]，PD-L1 与PD-1 结合可引起免疫细胞功能障碍，诱导免疫耐受，发挥负性免疫调节作用，主要表现为中性粒细胞的吞噬功能降低，DC 抗原提呈能力下降，NK 细胞增殖、分泌功能受损，T、B 细胞凋亡增加，Treg 数量增加。PD-L1 与PD-1 分子结合后会影响共刺激信号的传递，抑制抗原提呈细胞对T、B 细胞的活化，发挥免疫抑制作用，而T 细胞表面PD-1 与肿瘤表面表达的PD-L1结合后，可抑制T 细胞的增殖和活化，触发免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受，促进肿瘤生长[11-14]。目前很多研究表明PD-1 和PD-L1 在多种恶性肿瘤中均有高表达，但是对于不同的肿瘤，PD-1 和PD-L1的表达与其临床指征并不完全一致[15.16]。本研究通过对46 例胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织进行检测发现，46 例患者胃癌组织中PD-1 蛋白表达阳性率为78.26%（36/46），高于PD-L1 的58.70%（27/46），差异有统计学意义（P＜0.05），且不同TNM 分期PD-1 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同肿瘤浸润情况PD-L1 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与李雪薇[17]研究结果相一致；同时，WB 法检测显示，在胃癌细胞中PD-1 和PD-L1 均有表达，提示PD-1 表达与TNM 分期有关，PD-L1 表达与肿瘤浸润情况有关，二者可能参与胃癌的发生发展，并可能作为胃癌的一个潜在治疗靶点。

综上所述，PD-1 和PD-L1 在胃癌的发生发展中起到了一定的作用，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关，已成为胃癌肿瘤研究中的重要因子，有望成为胃癌筛查及诊疗的重要标志物，在肿瘤侵袭转移的评估、预后判断和治疗方面有着广阔的临床应用前景。