胁迫萌发对青稞籽粒中β-葡聚糖和γ-氨基丁酸含量的影响

李婷玉 杜 艳 陈正行 周文菊 涂兆鑫 李 娟

(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室；江南大学1，无锡 214122)(青海华实科技投资管理有限公司2，西宁 810016)(江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心；江南大学3，无锡 214122)

青稞营养丰富，蛋白质含量适中，且脂肪含量较低，并含有丰富的矿质元素、维生素、膳食纤维以及β-葡聚糖、γ-氨基丁酸(GABA)和α-生育三烯醇等多种生理功效成分，其生态特性和营养保健作用都是其它粮食作物无法比拟的。其中，青稞中的β-葡聚糖平均含量为5.25%，是目前世界上β-葡聚糖含量最高的麦类作物。β-葡聚糖具有调节血糖、降低胆固醇、提高免疫力等功能[1]。GABA具有降血压、神经营养功能、抗癫痫病、生殖生理功能等多种生理功能[2]。

发芽可用于改善谷物的外观、质地、风味、口感及其营养价值。然而，发芽通常导致谷物中β-葡聚糖的分解，β-葡聚糖被内源性的β-葡聚糖酶水解。金属离子对谷物萌发过程中β-葡聚糖的含量和β-葡聚糖酶的活性有很大影响。钟正升[3]研究发现Mg2+、Zn2+、K+、Na+有助于β-葡聚糖酶的生成及β-葡聚糖的分解; Cu2+会抑制β-葡聚糖酶活性及β-葡聚糖的降解。毕静[4]的研究结果表明Cu2+和Fe2+对酶活有明显的抑制作用。彭维[5]的研究表明Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Ca2+对β-葡聚糖酶具有激活作用，而Cu2+对其起抑制作用。富硒发芽可以抑制发芽青稞中β-葡聚糖的降解[6]。萌发可诱导生物活性成分的变化，尤其可以积累GABA等营养物质。研究表明，当植物暴露于许多不利条件时，如缺氧、干旱、低温、高温、高盐等，GABA的积累迅速增加，表明GABA在非生物胁迫中可能起主要作用[7]。低温胁迫[8-11]是促进GABA积累的有效途径。Wallace等[12]研究发现，低温胁迫通过改变植物细胞结构，降低pH，激活谷氨酸脱羧酶(GAD)活力从而促进GABA生成，同时抑制GABA转氨作用，使GABA得到积累，但低温胁迫萌发对β-葡聚糖含量的影响研究较少。

本实验以青稞籽粒为原料，在萌发过程中采用金属离子、亚硒酸钠和低温胁迫处理的方式，研究不同胁迫方式下青稞籽粒中主要功能性成分β-葡聚糖和GABA含量的变化情况和规律，以期为功能性青稞产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

青稞(瓦蓝，2019年9月收获)；七水合硫酸镁、硫酸锌、五水合硫酸铜、六水合氯化亚铁、十二水合氯化铁、亚硒酸钠、四氢呋喃、三乙胺、盐酸、结晶乙酸钠、四硼酸钠、2-巯基乙醇、三氯乙酸(TCA)、冰醋酸、氢氧化钠、无水乙醇，均为分析纯；次氯酸钠(有效氯6%～14%)、邻苯二甲醛(OPA)、γ-氨基丁酸标准品(色谱级)、Megazyme β-葡聚糖混联检测试剂盒、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)。

1.2 仪器设备

BSC-250型恒温恒湿箱， GZX-9246 MBE型数显鼓风干燥箱， 150型高速多功能粉碎机， LXJ-IIB型低速大容量多管离心机， UV-3200型紫外分光光度计， KQ-50E型超声波清洗器， NexIon 350D型电感耦合等离子体质谱仪， Agilent 1260 series 型高效液相色谱仪， Agilent Hypersil ODS柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)。

1.3 方法

1.3.1 发芽青稞的制备

选取饱满的青稞籽粒，用体积分数为0.2%～1%次氯酸钠溶液浸泡消毒30 min后，去离子水清洗3～4次，再用去离子水在25 ℃下浸泡10 h。随后，在直9 cm 的培养皿底部铺四层纱布，然后均匀铺放200粒青稞籽粒，在上面盖2 层湿纱布。在温度为15 ℃、相对湿度95%、避光的条件下发芽培养，每隔6 h洒100 mL去离子水。分别于发芽24、48、72 h时取样，用去离子水洗涤3次后，用80 ℃热水灭酶处理10 min，40 ℃干燥12 h，粉碎(过50目筛)。

1.3.2 金属离子胁迫萌发

发芽48 h，在培养过程中喷洒不同浓度(0.04、0.08、0.16 g/L)金属离子溶液(Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+)[5]。其余具体胁迫萌发方法同1.3.1。

1.3.3 亚硒酸钠胁迫萌发

发芽48 h，在培养时喷洒不同浓度(4、8、16 mg/L)的亚硒酸钠的溶液[6]。其余具体胁迫萌发方法同1.3.1。

1.3.4 低温胁迫萌发

将洗净浸泡后的青稞籽粒分别在5 ℃和-20 ℃胁迫24、48、72 h取出并在室温下回温30 min后萌发24 h。其余具体胁迫萌发方法同1.3.1。

1.3.5 β-葡聚糖含量测定

按照NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》。

1.3.6 GABA含量测定

采用OPA柱前衍生反相高效液相色谱-紫外检测法。

供试品溶液的制备：精确称取1.0 g青稞粉，加入5%三氯乙酸适量，摇匀，并定容至25 mL，常温超声40 min，离心(4 000 r/min，10 min)。取上清液，过0.22 μm滤膜。

色谱条件：色谱柱：Agilent Hypersil ODS柱(4.0 mm×250 mm,5 μm)。流动相A(pH=7.2)为27.6 mmol/L 乙酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比为500∶0.11∶2.5)，流动相B(pH=7.2)为80.9 mmol/L 乙酸钠-甲醇-乙腈(体积比为1∶2∶2)，流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃。检测波长338 nm。采用梯度洗脱，洗脱程序为：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24.0 min，0% B。

衍生条件：用高效液相色谱系统自动衍生装置，将200 μL 供试品溶液和400 μL衍生剂[13]反应2 min。

1.3.7 金属离子残留量

按照GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》。

1.3.8 数据分析

所有实验均重复2次，结果以平均值±标准差表示。应用SPSS软件进行方差分析，显著性分析采用Ducan’s多重检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 发芽对青稞β-葡聚糖和GABA含量的影响

由图1可知，随着胁迫萌发时间延长，青稞中β-葡聚糖含量呈现下降的趋势。这可能是因为青稞在发芽时，胚上皮层细胞分泌了赤霉酸，刺激胚乳糊粉层合成β-葡聚糖酶，水解胚乳细胞的β-葡聚糖[14]，从而使得β-葡聚糖含量减少。其中，β-葡聚糖含量在发芽48～72 h时降解速率最快。这可能是因为发芽早期，β-葡聚糖酶活性较小，β-葡聚糖降解较慢。随着发芽时间延长，β-葡聚糖酶活性增加，进而加快了β-葡聚糖降解。在整个发芽过程中，青稞中GABA含量总体呈先增加后减少的趋势。GABA在发芽前期(0～24 h)积累较慢，到了发芽中期(24～48 h)GABA积累最快，而到了发芽后期(48～72 h) GABA含量减少。这是因为青稞籽粒在发芽初期，蛋白酶未被充分激活，随着发芽时间延长，蛋白质水解形成了谷氨酸，在谷氨酸脱羧酶的作用下使得谷氨酸转化为GABA[15]。而GABA的生成与消耗是一个动态平衡的过程[16]，随着GABA的积累，反遏抑制了GAD酶的活性而促进了GABA转氨酶的活性，使GABA转化为琥珀酸半醛，从而导致GABA含量的下降[17]。

图1 发芽对青稞β-葡聚糖和GABA含量的影响

2.2 金属离子胁迫萌发对青稞β-葡聚糖和GABA含量的影响

由表1可知，采用5种金属离子胁迫萌发48 h β-葡聚糖含量低于对照组，明显可以促进β-葡聚糖降解，可能是因为Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+可以促进β-葡聚糖酶的活性[5-7]。而且采用5种金属离子胁迫青稞萌发48 h 后GABA含量均低于对照组，表明Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+胁迫萌发抑制了青稞中GABA的积累。在5种金属离子中，用Zn2+胁迫萌发48 h GABA含量增加量最少，最不利于GABA富集。关于Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+胁迫萌发对青稞籽粒 GABA富集效果的研究还鲜见报道，可能是因为金属毒害导致青稞萌发能力丧失[17]。

用不同浓度的Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+溶液胁迫萌发青稞种子会造成金属离子进入种子，形成富集，而这些离子摄入过多对人体造成一定的伤害。因此本实验对经不同浓度(0.04、0.08、0.16 g/L)金属离子溶液(Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+)胁迫48 h的发芽青稞中的Fe、Cu、Mg、Zn残留量进行了检测。经测定，用Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+胁迫发芽48 h的发芽青稞中各元素的残留量如表2所示，Cu、Zn残留量低于NY 861—2004 粮食(含谷物、豆类、薯类)及制品中铅、镉、铬、汞、硒、砷、铜、锌等8种元素限量中规定的上限(10.50 mg/kg)。

2.3 亚硒酸钠胁迫萌发对青稞β-葡聚糖和GABA含量的影响

Marco等[19]研究发现，亚硒酸钠会影响小麦籽粒的发育，减缓胚根的生长，一定浓度的亚硒酸钠溶液会抑制植物籽粒的生长，进而减缓了β-葡聚糖的降解速率。由图2可知，4 mg/L的亚硒酸钠溶液胁迫下的发芽青稞中β-葡聚糖含量高于对照组，8、16 mg/L亚硒酸钠溶液胁迫下的发芽青稞中β-葡聚糖含量明显低于对照组，表明亚硒酸钠溶液浓度较低时可以抑制发芽青稞中β-葡聚糖的降解，亚硒酸钠溶液浓度较高时可以促进发芽青稞中β-葡聚糖的降解。4、8、16 mg/L亚硒酸钠溶液作用下的发芽青稞GABA含量低于对照组，表明亚硒酸钠不利于GABA积累。可能是由于一定浓度的亚硒酸钠溶液会抑制植物籽粒的生长。

用不同浓度的亚硒酸钠溶液胁迫萌发青稞种子，会造成硒进入种子，形成富集，而这些元素摄入过多对人体造成一定的伤害。因此本实验对经不同浓度(4、8、16 mg/L)亚硒酸钠溶液胁迫48 h的发芽青稞中的硒残留量进行了检测。经测定，用亚硒酸钠胁迫发芽48 h的发芽青稞中硒的残留量如表3所示，硒残留量低于NY 861—2004 粮食(含谷物、豆类、薯类)及制品中铅、镉、铬、汞、硒、砷、铜、锌等8种元素限量中规定的上限(300 μg/kg)。

表1 金属离子胁迫萌发对青稞中β-葡聚糖和GABA含量的影响

表2 发芽青稞中金属的残留量/mg/kg

表4 低温胁迫萌发对青稞中β-葡聚糖和GABA含量的影响

图2 亚硒酸钠胁迫萌发对青稞β-葡聚糖和GABA含量的影响

表3 发芽青稞中硒的残留量/μg/kg

2.4 低温胁迫对青稞β-葡聚糖和GABA含量的影响

由表4可知，-20 ℃胁迫条件下β-葡聚糖含量比5、15 ℃高，这可能是由于过低温度破坏了青稞细胞结构导致的[8]，青稞发芽率严重下降，抑制了青稞的发芽活力，钝化了大部分β-葡聚糖酶，β-葡聚糖降解很少。5 ℃胁迫条件下β-葡聚糖含量比15 ℃高，这可能是较低的温度抑制了β-葡聚糖酶的活性，β-葡聚糖降解越少。

-20 ℃胁迫条件下发芽青稞中GABA含量显著高于15 ℃的原因是由于胁迫温度过低形成了冰晶体，破坏了植物细胞内部结构，Ca2+、H+等渗入细胞质激活细胞质中钙调素结合区的GAD活性，催化谷氨酸脱羧生成GABA[20]，同时催化其转氨降解的酶活性受到抑制，GABA转氨作用减弱，使GABA得以大量积累。15 ℃发芽青稞中GABA含量显著高于5 ℃的原因可能是由于胁迫温度较高时，青稞对外界逆境环境反应不强，GAD激活不彻底，同时GABA转氨作用增强，将GABA氧化降解形成琥珀酸，为TCA循环提供所需碳源，造成了GABA及其合成原料的消耗[21]，使得发芽青稞中GABA含量有所下降。

3 结论

青稞籽粒在萌发过程中可以产生GABA，提高了GABA含量，但青稞中β-葡聚糖则逐渐被降解。低温-20 ℃胁迫萌发，可以促进青稞中GABA的大量富集，且部分胁迫萌发方式(低温-20 ℃)可以抑制β-葡聚糖的降解。此外，部分胁迫萌发方式(5种金属离子、亚硒酸钠、低温5 ℃)却促进了β-葡聚糖的降解。