青海亚麻籽中木脂素含量测定及抗氧化活性分析

陈昀昀

王进英1,2

王兴瑞1

韩玉泽1

李应霞1

王淑珍1

(1. 青海大学农牧学院，青海 西宁 810016；2. 青海大学三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

亚麻籽是木脂素最丰富的天然谷物来源，是其他谷物资源的75～800倍[1]。开环异落叶松酚葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)是亚麻籽中主要的木脂素，一部分以游离形式存在，一部分与3-羟基-3-甲基-戊二酸通过酯键结合形成低聚体；其他酚类化合物如对香豆酸、阿魏酸与糖基以糖苷键结合的方式存在于低聚体中[2]。通过碱水解和酸水解使酯键与糖苷键断裂，可生成SDG、对香豆酸糖苷、开环异落叶松脂素(secoisolariciresinol，SECO) 等[3-4]。亚麻木脂素对癌症、糖尿病和心血管疾病具有化学预防作用，其药理活性被认为是因其具有高的抗氧化能力和植物雌激素活性[5-8]。

目前，关于亚麻籽的研究主要集中在对其营养品质评价、活性物质提取与含量分析、保健食品开发等方面，而关于青海地区亚麻研究主要集中在育种的发展，对于亚麻籽中木脂素含量与抗氧化活性的差异性研究尚未见报道。试验拟采用反相高效液相色谱法定量测定青海9个产地、20种亚麻籽中木脂素含量及其抗氧化能力，为促进青海地区亚麻籽及其加工副产物的高值化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20种亚麻籽：详见表1。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海晶纯生化科技股份有限公司；

2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：北京索莱宝科技有限公司；

亚麻木脂素(SDG、SECO)标准品：四川德斯特生物公司；

氢氧化钠、磷酸、盐酸：分析纯，天津市河东区红岩试剂厂；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国默克公司。

1.2 仪器与设备

超声波清洗机：SB-3200TDT型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

循环水真空泵：SHZ-III型，上海亚荣生化仪器厂；

分析天平：DSH-50-5型，上海越平科学仪器有限公司；

液相色谱仪：LC-20A型，日本岛津公司；

表1 20种亚麻籽样品信息

紫外分光光度计：UV-2600型，日本岛津公司；

脂肪测定仪：SOX406型，山东海能科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂亚麻籽粉的制备 亚麻籽清理、分拣、粉碎后得到亚麻籽粉，利用索氏抽提法脱脂，热风干燥得脱脂亚麻籽粉。

1.3.2 亚麻木脂素的提取 根据文献[9-10]并修改：称量每种脱脂亚麻籽粉4 g，提取溶剂为60%乙醇，固液比(m脱脂亚麻籽粉∶V乙醇)1∶15 (g/mL)，超声功率400 W，超声时间15 min，抽滤，离心，上清液减压浓缩后得SDG聚合物提取液。用0.2 mol/L的NaOH 溶液将提取液pH值调至11，50 ℃水浴2 h，用1 mol/L盐酸调节中和，低温浓缩后得SDG提取液，经0.45 mm醋酸纤维膜过滤，待HPLC测定。

精确量取5 mL SDG溶液，用1 mol/L盐酸调pH值至2.5，90 ℃水浴酸解3 h，得SECO提取液，经0.45 mm醋酸纤维膜过滤，待HPLC测定。

1.3.3 亚麻木脂素标准品标准曲线的制备 准确将亚麻木脂素SDG和SECO标准品配制成一定浓度范围的标准液。在已确定的液相色谱条件下进行上样检测，将标准物质质量浓度X与峰面积Y进行线性回归，得标准曲线(见表2)。根据色谱保留时间与峰面积进行定量，结果以干基表示(mg/g)。

1.3.4 液相色谱法测定亚麻木脂素含量 液相色谱条件见表3，以亚麻木脂素标准品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合得回归方程，并按式(1)计算亚麻籽木脂素含量。

(1)

式中：

M——亚麻木脂素含量，mg/g；

C——提取液中木脂素的质量浓度，mg/mL；

V——提取液体积，mL；

N——稀释倍数；

W——脱脂亚麻籽粉末的质量，g。

1.3.5 亚麻木脂素抗氧化活性测定 参照文献[11-13]并稍作修改。

(1) DPPH自由基清除能力：用体积分数为60%的乙醇将样品液稀释50倍，充分振摇均匀，与0.2 mmol/L的DPPH溶液按V样品液∶VDPPH液=1∶1混合，室温避光静置30 min，测定517 nm处吸光值，按式(2)计算DPPH自由基清除率。

表2 SDG和SECO的峰面积回归分析

表3 亚麻木脂素液相色谱条件

(2)

式中：

C——自由基清除率，%；

A0——空白组吸光值；

A1——样品组吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力：7.40 mmol/L ABTS溶液与2.60 mmol/L过硫酸钾溶液按VABTS溶液∶V过硫酸钾溶液=1∶1 混匀，室温避光静置12 h，使用前用无水乙醇稀释，使吸光度在734 nm处为 0.70±0.02，得ABTS工作液。配制不同质量浓度样液，分别取1.00 mL，加入ABTS工作液 3.00 mL，混匀，避光静置10 min，测定734 nm处吸光度，并按式(2)计算ABTS自由基清除率。

1.4 数据处理分析

试验数据平行测定3次，结果取平均值。运用SPSS 26.0软件进行数据统计分析，相关性分析采用Pearson双侧检验法，显著性差异采用LSD多重比较法。Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种亚麻籽木脂素含量分析

由表4可知，SDG含量为7.53～23.33 mg/g，SECO含量为0.85～2.55 mg/g。不同品种亚麻籽木脂素含量之间具有显著性差异(P<0.05) 。

亚麻籽木脂素经碱水解后主要得到SDG，不同品种间SDG含量差异较大，含量最高的品种产自于海北门源(QH-19)为(23.33±0.14) mg/g，含量最低的品种产自于西宁大通(QH-4)为7.53 mg/g。SDG含量≥20 mg/g的品种有5种，其余15个品种亚麻籽中的SDG含量为7～19 mg/g。亚麻籽木脂素经酸水解后主要得到SECO，海北门源(QH-19)亚麻籽中SECO含量最高为(2.55±0.12) mg/g，西宁湟源(QH-5)亚麻籽中SECO含量最低为(0.85±0.22) mg/g。SECO含量≥2 mg/g的品种有5种，其余15个品种亚麻籽中的SECO含量为0.89～1.99 mg/g。此外，亚麻籽中SDG和SECO(r=0.986，P<0.01)含量具有显著相关性，表明SDG含量高的亚麻籽品种，SECO含量也相对较高。这可能与亚麻籽中木脂素的存在形式及稳定性有关。亚麻籽中的SECO与糖苷结合，以开环异落叶松酚葡萄糖苷(SDG)形式存在。SDG聚合物碱水解会游离出SDG，通过酶水解或酸水解使SDG糖苷键断裂，释放出SECO[2]。这也可能是受收获成熟度的影响。因为亚麻籽成熟过程伴随着催化木酚素合成酶的表达和活性的改变[14-16]。综上，海北门源(QH-19)亚麻籽中两种木脂素含量最高。

2.2 不同产地亚麻籽木脂素含量分析

由图1可知，青海不同产地亚麻籽样品中的木脂素含量均具有显著性差异(P<0.05)。海北门源、海东乐都、西宁湟中、海东民和及海东互助的亚麻籽样品中的2种木脂素含量均显著高于海东平安、海东循化、西宁湟源和西宁大通的。

不同产地的亚麻籽中SDG含量差异较大。西宁湟中亚麻籽中的SDG平均含量为(16.95±5.09) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品种有2个；海东互助亚麻籽中的SDG平均含量为(15.77±3.38) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品种有3个；海东民和亚麻籽中的SDG平均含量为(16.86±4.95) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g 的品种有2个；海东平安亚麻籽中的SDG平均含量为(14.62±3.20) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品种有2个；海北门源亚麻籽中的SDG含量最高，为(23.33±0.14) mg/g，西宁大通的最低，为7.53 mg/g。

不同产地的亚麻籽中SECO含量差异性显著(P<0.05)。西宁湟中亚麻籽中的SECO平均含量为(1.83±0.58) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品种有2个；海东互助亚麻籽中的SECO平均含量为(1.73±0.38) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品种有3个；海东民和亚麻籽中的SECO平均含量为 (1.74±0.69) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品种有2个；海东平安亚麻籽中的SECO平均含量为(1.58±0.35) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品种有2个；海北门源亚麻籽中SECO含量最高为(2.55±0.12) mg/g，西宁湟源的最低，为(0.85±0.22) mg/g。

表4 青海不同品种亚麻籽中木脂素含量†

字母不同表示差异显著(P<0.05)

综上，青海省9个不同产地中海北门源、海东乐都、西宁湟中以及海东民和亚麻籽样品中的木脂素含量显著优于其他5个产地，其含量趋势是海拔越高、纬度越高、气候越冷凉，亚麻籽中木脂素含量越高，与胡哓军等[17]的结论基本一致。

2.3 亚麻籽中木脂素抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基比羟基自由基和超氧自由基更加稳定[18]，因此DPPH自由基清除能力常被用作评价抗氧化能力的一种方法。由表5可知，20种亚麻籽中两种木脂素均具有较强的抗氧化能力，且不同样品间差异显著(P<0.05)。SDG和SECO对DPPH 自由基的清除率分别为53.18%～62.97%，52.87%～61.86%。其中，海北门源(QH-19)亚麻籽样品的抗氧化能力较强，SDG和SECO的DPPH自由基清除率分别为62.97%，61.86%；西宁大通(QH-4)亚麻籽样品的抗氧化能力最低，SDG和SECO的DPPH自由基清除率分别为53.18%，52.87%。

从青海省不同产地来看，海北门源、海东乐都、海东平安、西宁湟中亚麻籽样品中SDG的DPPH自由基清除率较强，分别为62.97%，59.34%，58.50%，58.50%；SECO的DPPH自由基清除率较强的产地分别是海北门源、海东乐都、海东民和、西宁湟中，分别为61.86%，60.32%，56.89%，56.73%。综上，海北门源、海东乐都、海东平安、海东民和以及西宁湟中的亚麻籽木脂素的抗氧化活性优于其他产地的。不同产地及同一产地间亚麻木脂素抗氧化能力存在差异，与臧茜茜等[8]的研究结果一致。亚麻木脂素含量及抗氧化活性会受品种、生长环境、气候条件、贮藏时间等因素的影响，因此木脂素含量及抗氧化活性存在不同程度的差异[1,19-20]，而且不同品种的同一物种间，营养成分含量也不同[21]。

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由表6可知，青海20种亚麻籽中两种木脂素均具有较强的抗氧化能力，且不同样品间差异显著(P<0.05)。SDG和SECO对ABTS自由基的清除能力分别为52.98%～62.59%，51.08%～61.99%。其中，海北门源(QH-19)亚麻籽样品的抗氧化能力较强，SDG和SECO的ABTS自由基清除率分别为62.59%，61.99 %；西宁大通(QH-4)亚麻籽样品的抗氧化能力最低，SDG和SECO的ABTS自由基清除率分别为52.98%，51.08%。

表5 DPPH自由基清除能力†

从青海省不同产地来看，海北门源、海东乐都、海东民和、海东平安亚麻籽样品中SDG的ABTS自由基清除率较强，分别为62.59%，62.33%，60.19%，58.92%。SECO的ABTS自由基清除率较强的产地分别是海北门源、海东乐都、西宁湟中、海东民和，分别为61.99%，60.59%，60.23%，60.01%。综上，海北门源、海东乐都、西宁湟中、海东民和的亚麻籽木脂素的抗氧化活性优于其他5个产地的，可能是由于亚麻籽中木脂素含量不同。

3 结论

青海省9个产地的亚麻籽中木脂素含量及抗氧化能力差异性显著(P<0.05)，其中海北门源(QH-19)的亚麻籽木脂素含量最高，西宁大通(QH-4)的最低，前者的木脂素含量是后者的约3倍。海东民和、海东互助、海东乐都的亚麻籽中木脂素含量高于西宁大通及西宁湟源的。青海省亚麻籽中木脂素也具有较强的抗氧化能力，其中，海北门源(QH-19)亚麻籽样品的抗氧化活性最强。9个产地中海东乐都、海东平安、海东民和及西宁湟中的亚麻籽木脂素的抗氧化活性显著高于其他5个产地的。后续可进一步扩大青海省不同产地和品种样本量，并对木脂素的活性进行更深入探究，从而为青海亚麻籽深加工和综合利用提供理论支持。

表6 ABTS自由基清除能力†