锶、钴共掺杂纳米管种植体对骨质疏松大鼠骨结合的影响

杨瑶瑶 袁文红 张倩倩 宋宇 曲雅馨 于艳玲

种植义齿因其良好的功能及美学效果被认为是缺牙患者的首选修复方式。尽管种植手术取得了长足的发展，但在一些特殊人群如骨质疏松患者中表现欠佳，骨质疏松患者骨小梁和骨密度较低，极易导致种植失败［1］，如何提高骨质疏松患者种植修复效果是口腔医学领域面临的难题。

种植体表面形貌处理改善骨结合效果是一种很有潜力的方法。大量文献表明将钛植体表面处理成TiO2纳米管形貌能够提高蛋白和细胞的粘附从而更好地促进骨结合［2］。有学者提出纳米管管状结构可作为一种优良的载体，递送离子、药物等［3－4］促进骨结合。锶 （Sr）元素已被证明具有促进新骨形成和抑制破骨吸收的双重作用，广泛应用于骨质疏松症的临床治疗［5］。钴 （Co）元素能够稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）并激活靶基因VEGF模拟体外低氧环境来增强血管生成［6］，本实验将种植体表面处理成纳米管结构，水热法分别加载锶、钴元素，构建5种不同形貌，即光滑组（smooth titanium，ST）、纳米组（nano titanium，NT）、纳米锶组（nano titanium-strontium，NT-Sr）、纳米钴组（nano titaium-cobalt，NT-Co）、纳米锶钴组（nano titanium-strontium-cobalt，NT-Sr-Co），探究将具有促进成骨作用和促进血管新生作用的两种元素结合能否更好地促进骨质疏松大鼠的骨结合。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

3月龄雌性SD大鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司）；99.99%纯钛钛片、纯钛种植体（东莞市升跃精密五金制品有限公司）；氯化锶、氯化钴（阿拉丁，美国）；马弗炉（天津市中环实验电炉有限公司）；场发射扫描电镜（ZEISS Sigma 300，德国）；X射线光电子能谱仪（ThermoFisher，美国）；micro-CT（μCT-100，德国）；EXAKT 300 CP/400CS/AW 硬组织切磨系统（EXAKT，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 不同形貌材料的制备及观察 直径14 mm×1 mm的圆形钛片逐级抛光、超声清洗后置于1.25 wt%的氢氟酸溶液中20 V电压下阳极氧化1 h制备TiO2纳米管形貌，经马弗炉400℃、2 h退火处理，配置0.02 mol/L的 Sr溶液和0.001 mol/L的 Co溶液于200℃、4 h条件下进行水热反应，构建5组形貌：ST组，NT组，NT-Sr组，NT-Co组，NT-Sr-Co组，分别采用扫描电子显微镜（SEM）观察和 X射线光电子能谱仪（XPS）分析。

1.2.2 动物模型的建立 实验选取35只3月龄SD大鼠（180±15）g，遵照青岛市口腔医院中心实验室管理规定置于无菌动物房中饲养，大鼠适应性饲养1周后随机分为实验组（30只）和对照组（5只），实验组采用双侧卵巢摘除术（OVX）建立骨质疏松模型，对照组即假手术组仅打开腹腔摘除部分脂肪。3个月后进行微计算机断层扫描技术（micro-CT）检测骨质疏松模型是否构建成功。

1.2.3 动物实验 模型大鼠随机分为5组，每组6只。将直径2 mm×4 mm的纯钛种植体按相同工艺制备成5组不同形貌，无菌操作下分别植入5组大鼠双侧股骨干骺端，每侧股骨植入1颗种植体，每只大鼠植入同种种植体。术后3 d连续肌注抗生素。4周后对大鼠实行安乐死，切取含有种植体的股骨，浸于4%多聚甲醛中备用。

1.2.4 micro-CT扫描 μCT-100显微 CT以种植体为轴心，向周围骨展开约2 mm进行扫描和三维重建。扫描参数为：电压70 kV，电流200μA，分辨率14.8 μm，曝光时间：300 ms，对骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁间隙（Tb.Sp）进行定量分析。

1.2.5 甲苯胺蓝染色 EXAKT 300 CP/400CS/AW硬组织切磨系统制备约50μm厚不脱钙种植体－骨组织磨片，甲苯胺蓝染色后中性树脂封片。光学显微镜下采集图像并测量计算骨接触率（bone implant contact，BIC）。

2 结 果

2.1 材料学表征观察

SEM：ST组表面接近平坦，可见少量微坑状抛光划痕；NT组则呈现蜂窝状、管壁均匀，规则一致的纳米管结构，管径约为80～85 nm左右（图1）。

图1 ST组和NT组扫描电镜图Fig 1 SEM images of ST group and NT group

XPS：各组Ti和O光谱均对应经典峰值（图2）。NT-Sr组除显示Ti和O外，还包含Sr的峰值，结合能为133.34 eV；NT-Co组出现了Co的特征峰，结合能为780.13 eV；NT-Sr-Co组则同时拥有Sr和Co两个特征峰，表明水热反应成功负载Sr和Co元素。

图2 NT-Sr组、NT-Co组、NT-Sr-Co组表面元素能谱图Fig 2 Surface element energy spectra of NT-Sr group，NT-Co group and NT-Sr-Co group

2.2 micro-CT扫描骨质疏松动物模型

图3为OVX组和假手术组大鼠股骨的micro-CT剖面图，OVX组骨密度明显降低，说明骨质疏松动物模型构建成功，可进行下一步实验。

图3 OVX术后2组股骨剖面图Fig 3 Section view of femurs in 2 groups after OVX

2.3 micro-CT扫描种植体－骨组织

4周后种植体周围三维重建图见图4，NT-Sr组、NT-Co组、NT-Sr-Co组3组间定量分析结果见图 5，NT-Sr组和NT-Sr-Co组以及NT-Co组和NT-Sr-Co组间均具有统计学意义（P＜0.05），而 NT-Sr组和 NTCo组之间无统计学差异（P＞0.05）。

图4 4周后种植体周围新生骨情况（micro-CT）Fig 4 New bone formation around the implant4 weeks after implantation（micro-CT）

图5 5组骨组织参数Fig 5 Bone tissue parameters of the 5 groups

2.4 组织学观察

光镜下可以清晰地观察到4周时种植体明显被新生骨包围，在磨片上显示为深蓝色，黑色部分为种植体（图 6）。选择感兴趣区域（region of interest，ROI）计算种植体骨结合率（BIC%），NT组显著高于ST组（P＜0.01），NT-Sr组显著高于 NT组（P＜0.01），NT-Co组高于NT组（P＜0.05），NT-Sr-Co组显著高于 NT-Sr组和NT-Co组（P＜0.01），而NT-Sr组与NT-Co组间无统计学差异（P＞0.05）。

2.5 统计分析

使用 Graphpad 8.0绘图软件，对不同分组间进行单因素方差分析，同一组间进行多重比较，P＜0.05时认为有差异；P＜0.01时认为有显着性差异。

3 讨 论

骨质疏松症是一种影响数百万人的代谢性疾病，患有骨质疏松患者的种植成功率明显降低，钛植体的表面形貌能够显著影响成骨细胞的粘附，增殖和分化［7］。若能通过种植体表面处理提高骨结合能力则是一种很有前途的方法。TiO2纳米管结构因能明显改善骨结合效果和具有载体功能成为近几年的研究热点［8］。先前的研究证明，锶（Sr）具有促进骨骼形成和减少骨吸收的双重作用［9］，钴（Co）具有促进血管新生的作用［10］，但钴离子过量掺入会导致细胞毒性［11］。因此本研究尝试通过阳极氧化法和水热反应法制备一种新型多功能的Sr、Co共掺杂纳米管种植体，评估两者结合对骨质疏松大鼠骨结合的影响。

通过动物实验本研究发现4周后5组中NT-Sr-Co组骨结合率最高，说明新制备的载锶、钴纳米管种植体有效改善了骨质疏松大鼠的骨整合效果。各项定量分析数据也支持这种变化。骨体积分数（BV/TV）是反映骨骼重塑的最重要的参数，NT-Sr-Co组的骨体积分数相对于光滑组组增加了约1.9倍，说明NT-Sr-Co组的骨量增加了约1.9倍；BV/TV的显着性差异还被发现在NT-Sr-Co组和NT-Co组之间（P＜0.01），说明Sr能够明显改善种植体骨结合。4周后甲苯胺蓝染色实验发现种植体周围均为新生骨小梁包绕，骨质连续且与基骨之间分界明显。图7结果显示与ST组比较，NT组骨结合率显著升高（P＜0.01），说明将种植体表面处理成TiO2纳米管结构能够改善骨整合，与Lavenus等［12］研究结果一致。与NT组相比，NT-Sr组骨结合率显著提高（P＜0.01），说明Sr元素的加入能够明显增强骨质疏松大鼠的骨结合，文臣娟等［13］将锶掺入透钙磷石中，发现对MC3T3-E1细胞成骨功能有促进作用。Liang等［14］将锶元素加载到钛植体表面，也证明了锶元素能够明显促进骨整合，NT-Co组与NT组也具有统计学差异（P＜0.05），说明Co元素的掺杂相比未掺杂组NT组也改善了骨结合率，但作用力不如Sr元素明显，可能原因是Co元素仅在促进血管生成方面发挥作用，但对成骨细胞的作用不那么明显，具体机制我们还在探究中。但有文献报道Co除了诱导血管生成外，也表现出了成骨刺激作用［15－17］，而NT-Sr-Co组相比 NT组具有显著性差异（P＜0.01），说明Sr和Co元素的单独掺杂都能促进骨结合，Sr掺杂能够导致更好的骨形成，Co的改善作用远小于Sr，但当Sr、Co共掺杂时即可发挥良好的生物功能，可能是Co元素产生了协同作用，致使NT-Sr-Co组的骨结合率在5组中是最高的。

图7 5组BIC统计图Fig 7 BIC statistics of the 5 groups

综上所述，与传统的光滑Ti相比，TiO2纳米管结构能够促进骨结合，Sr元素能够明显改善种植体周围骨结合，Co元素也能在一定程度上改善骨结合，但效果不如Sr明显。本实验构建的NT-Sr-Co种植体通过动物实验证明诱导了更多的新骨生成和更紧密的骨结合，为需要种植手术的骨质疏松患者提供了一种新策略，具有巨大的牙科和骨科应用潜力。