UHPLC-MS/MS 测定人血浆中尿嘧啶与二氢尿嘧啶的浓度

童 萃，陈 顺，王志鹏，高守红 （海军军医大学附属长征医院药学部，上海 200003）

嘧啶类化疗药物在肿瘤治疗中的地位越来越重要，其代表药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨更受到了广泛关注，体内二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)是此类药物代谢的限速酶之一[1]，前瞻性评价DPD 的总体活性有利于提高药物疗效及减少患者的毒副反应，对临床具有重要意义。内源性物质尿嘧啶(U)是体内DPD 的天然底物，在此酶的催化下生成二氢尿嘧啶(UH2)，并最终通过尿液排出体外。测定血浆中U 和UH2的含量，并通过(UH2)/(U)比值计算，可从代谢物的角度评价DPD 的活性[2]。临床上常用评价DPD 酶活性的方法是测定患者的基因表型，DPD 的编码基因DPYD 序列中包含了多达7 600 个多态位点，使得DPD 酶的活性在人群中是高度可变的[3]。不同的突变位点及不同位点的组合给临床检测带来了极大的困难。到目前为止，也只有DPYD*2A 的多态性被用于临床实践，用来筛选出5-氟尿嘧啶代谢严重不良的患者，避免严重的毒副反应[4]。单一应用基因的多态性来评价DPD 酶的活性在临床上存在一定的困难，基因的多态性并不能直接同下游的酶的活性联系起来，两者并没有完全对等的关系。基因需通过转录、翻译和蛋白的修饰之后才能发挥作用。基因多态联合下游代谢物的含量测定更能准确的评价DPD 酶的活性[5]。目前常应用液相色谱-串联质谱联用法对人血浆或干燥唾液中U 和UH2浓度进行检测[6-11]，但所报道的方法均有一些复杂或难以重现。本研究成功的建立了一种灵敏、高效、准确、重现性好，且能同时测定人血浆中U 和UH2浓度的UHPLCMS/MS 方法，为体内DPD 总体活性提供更客观有效的评价途径。

1 材料与方法

1.1 仪器与耗材

1 290-6460A 超高效液相色谱-串联质谱仪，包含G4220A 二元泵、G4226A 自动进样器、G1316C柱温箱、MassHunter 数据处理工作站（美国Agilent）；调速涡旋混合器（美国Labnet）；SK7200H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；BSA124S-CW 分析天平（德国赛多利斯）；5810R 型低温高速离心机、移液器（德国Eppendorf 公司）。

1.2 药品与试剂

尿嘧啶、二氢尿嘧啶和氯尿嘧啶（内标）对照品（纯度>99%,大连美仑生物有限公司）；乙酸铵（美国赛默飞世尔科技）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇（色谱纯，德国默克公司）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）(上海博光生物科技有限公司)；生理盐水（长征医院药学部自制）。

1.3 色谱分离条件

色谱柱为Agilent poroshell 120 SB-Aq-柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流动相为5 mmol/L 乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速为0.3 ml/min，梯度洗脱：0～0.3 min，100% A；0.3～1.0 min，100%～10% A；1.0～2.5 min，10% A；柱温为30 ℃，洗脱时间2.5 min，进样量5 μl。

1.4 质谱分离条件

采用ESI 离子源，多重反应监测（MRM）进行一/二级质谱分析，用于定量分析的检测离子为：U[M+H]+m/z113.0→40.1，检测模式为正离子模式；UH2[M+H]+m/z115.0→55.1，检测模式为正离子模式；氯尿嘧啶（IS）[M-H]-m/z145.0→42.1，检测模式为负离子模式。雾化温度为300 ℃，雾化气压力为40 psi，干燥气流速为10 L/min，鞘气温度300 ℃，鞘气流速12 L/min，解离电压为4 000 V。

1.5 样本采集

选取8 名血浆样品指标正常的成年人，于当日清晨8 时空腹状态下静脉采血3 ml, EDTA-3K 管抗凝，离心后分离上层血浆, 于−80 ℃冰箱冻存。

1.6 样本预处理

取100 μl 样本，加10 μg/ml 氯尿嘧啶（IS）10 μl，加乙酸乙酯3 ml，涡旋5 min，1 710×g离心10 min，取上层有机相2.7 ml，45 ℃氮气挥干仪挥干，用10%甲醇溶液100 μl 复溶，涡旋1 min，取上清液进样分析。

1.7 标准溶液配制

用含有3 %牛血清白蛋白作为空白基质代替血浆配置标准曲线样品。取100 μg/ml 的尿嘧啶和二氢尿嘧啶各100 μl，加800 μl 水，制成10 μg/ml标准混合液，置于−20 ℃备用。取10 μg/ml 标准混合液适量，用3 %牛血清白蛋白稀释制成10、20、50、100、200、500、1 000、1 500 ng/ml 系列浓度样品, 然后按照上述“1.6”项下样品的处理方法配制。

2 结果

2.1 专属性考察

U 和UH2的出峰时间以及峰型良好，代替血浆经过前处理后，对待测组分的测定没有干扰，内标对分析物的测定也没有干扰，且能很好分离，结果见图1。

图1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶及内标质谱多反应监测色谱图

2.2 标准曲线和线性范围

U 和UH2的线性范围是10.0～1 500.0 ng/ml，以空白BAS 中U 和UH2的浓度为横坐标（X），U和UH2与内标化合物氯尿嘧啶的峰面积比为纵坐标（Y），进行最小二乘法加权（权重系数为1/χ2），U 和UH2的线性回归方程分别是Y=0.27X+0.002 2、Y=0.58X+0.038 0，r均>0.990，表明线性关系良好。

2.3 精密度和准确度

取定量下限、低、中、高标准添加血浆样本按照前处理方法进行处理，每个浓度样品平行制备5 份进行分析，连续3 d 重复操作，根据当天的标准曲线计算当天实测样本浓度，计算样本在低、中和高浓度下的日内、日间精密度和准确度，结果显示，精密度和准确度的偏差均在15%左右。准确度相对偏差在20%范围内时，最低定量下限精密度偏差不大于20%，结果见表1。

表1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的精密度 (n=5)

2.4 基质效应和提取回收率

取低、高2 个浓度的样本进行基质效应和提取回收率考察，结果显示，U、UH2及内标氯尿嘧啶的基质效应和提取回收率良好，结果均较稳定，结果见表2。

表2 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的基质效应和提取回收率

2.5 样品稳定性

考察低、高2 个浓度的血浆样品经历3 次冷冻与解冻循环的稳定性、血浆样品在室温（25 °C）放置6 h 后经样品处理后稳定性和血浆样品经样品处理后室温放置24 h 的稳定性，结果显示，3 次冻融、6 h室温（25 °C）条件下和24 h 放置自动进样器中的稳定性均符合要求，结果见表3。

表3 样品的稳定性(RE%)

2.6 样本检测

应用本研究所建立的方法，对8 名健康成人的血浆样本测定分析，在样本实测过程中, 同时插入已知浓度的随行质控样本(QC 样本), 随时监控样本测定的准确度。U 和 UH2浓度测定结果见图2。

图2 实测8 名健康成人内源性U 和UH2 浓度值

3 讨论

3.1 空白基质的选择

U 和UH2是人体内常见的两种物质，且同核酸的代谢密切相关，由于U 和UH2均为人体内源性物质，故不能采用人源的基质进行方法学的开发及验证，通过查阅资料，选择了不含U 和UH2的3%牛血清蛋白作为基质进行方法学的开发[12]。也有文献报道采用去除U 和UH2的人源血浆基质进行方法学实验[9]，但基质的来源较珍贵，不适合方法的普及，所以选用3%牛血清蛋白作为替代基质。

3.2 色谱柱的选择

U 因其特殊的化学性质，在大部分的色谱柱上均没有保留。U 和UH2的LogP值分别为−0.707和−0.840，有较强的亲水性，决定了其不保留的性质。在定量方法的开发过程中，先后采用了Agilent Zorbax SB-C18色谱柱， Agilent Zorbax Eclipse-C18色谱柱，Waters Atlantis T3色谱柱，Waters Xselect 色谱柱，Waters Xbridge 等色谱柱来进行条件摸索，但上述色谱柱对U 和UH2均没有保留。最后，采用Agilent Zorbax SB-Aq 对U 和UH2进行定量分析，该色谱柱对强极性的化合物有较好的保留效果，同时，兼容100%的起始流动相也对保留产生了良好的结果。

3.3 样本预处理的优化

本研究还分别考察了几种常见的处理方法，包括甲醇和乙腈的蛋白沉淀、Waters Oasis HLB 萃取板的固相萃取以及乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，二氯甲烷/三氯甲烷，环己烷进行的液液萃取，结果发现乙酸乙酯对U 和UH2的萃取效果较好，同时，还分别考察了5%、10%、20%、30%、40%、50%的异丙醇、乙酸乙酯溶液对U 和UH2的萃取效果，结果发现，单纯的乙酸乙酯对待测化合物具有较好的提取效率。提取回收率均高于90%，且RSD<10%。另外对3%牛血清蛋白的基质效应进行了考察，结果发现平均基质效应在85%～101%之间，RSD<7%，说明该前处理方法对于基质的清除较为彻底，测定结果稳定，没有明显的基质干扰。

本研究虽重在方法开发，收集的样本数量较少，但从测定的U 和UH2浓度分布来看DPD 对内源性U 的代谢存在个体差异，建议临床应用5-氟尿嘧啶及其卡培他滨筛查DPD 总体活性[12-13]，后续可进一步扩大样本数量进行深入研究。

4 结论

本实验建立了一种快速，稳定，高灵敏度的UHPLC-MS/MS 方法，可用于测定人体内源性物质U 和UH2的含量，从代谢物的角度评价DPD 酶的活性，从而协助临床医生制定化疗药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨合理的用量，以较低的毒副反应获得最大的临床疗效。