超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中非法添加物福莫特罗和阿福特罗

赵立军，张 静，岳 琴，林顺全，廖 峰，李 云

（农业农村部饲料质量监督检验测试中心（成都），成都610041）

β-受体激动剂是类似肾上腺素和去甲肾上腺素功能的化学合成药物，其基本化学结构为苯乙醇胺。临床上主要用于治疗支气管炎和哮喘等疾病[1-3]，该类药物用于畜牧生产，俗称“瘦肉精”，能显著提高动物胴体瘦肉率和提高饲料转化率，达到动物快速增重的目的[4-5]。有研究报道，β-受体激动剂易蓄积残留于动物体内，特别在肺脏、肝脏、肾脏残留量最高，严重危害人体健康[6-8]。福莫特罗是一种新型、高选择性的β-受体激动剂，临床上其具有强力而持续的支气管扩张作用，效果明显优于同等剂量的沙丁胺醇和特布他林[9]。福莫特罗分子中有两个手性中心，即存在RR、SS、RS和SR四种构型。阿福特罗是福莫特罗的RR构型对映异构体，其药效约为SS构型对映异构体的1 000倍[10-11]。我国农业农村部（原农业部）1519号公告明确禁止在饲料和动物饮用水中使用酒石酸阿福特罗（Arformoterol tartrate）和富马酸福莫特罗（Formoterol fumatrate）等β-受体激动剂[12]。

目前有关饲料中β-受体激动剂的液相色谱质谱检测方法很多，但主要关注的是“瘦肉精”测定[13-16]，尚无关于饲料中福莫特罗和阿福特罗总量的测定方法的报道。福莫特罗和阿福特罗是国家明令禁止在动物养殖中使用的物质，只要在饲料产品中检出两者中任何一种物质即判定为有非法添加物。为了使两种物质检测方法具有可操作性和实用性，本研究利用实验室常用的十八烷基硅烷键合硅胶柱建立了一种准确、灵敏的超高效液相色谱-串联质谱法测定福莫特罗和阿福特罗。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪（Agilent1290-6460 Triple Quad）、固相萃取装置，美国Agilent公司产品；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；涡旋振荡混合器，德国IKA公司产品；离心机，日本Hitachi公司产品；氮吹仪，美国Organomation公司产品；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

富马酸福莫特罗、酒石酸阿福特罗对照品（纯度≥98%）、福莫特罗-D6同位素内标物（纯度≥96%），加拿大TRC公司产品；Oasis MCX固相萃取柱（3 mL·60 mg-1），美国Waters公司产品；甲醇、甲酸（色谱纯），美国Sigma公司产品；盐酸（分析纯），重庆川东化工（集团）有限公司产品；乙酸铅（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司产品；氨水（分析纯），广东西陇化工股份有限公司产品；0.22μm有机系滤膜，天津市津滕实验设备有限公司产品；试验用水为Milli-Q超纯水，德国默克产品。

1.2 溶液配制

标准贮备液：精密称取福莫特罗、阿福特罗及福莫特罗-D6对照品适量，用甲醇配制成浓度约为1.00 mg·mL-1的标准贮备液，于2~8℃冷藏保存，有效期为6个月。使用时用0.2%甲酸水溶液逐级稀释至所需浓度。

盐酸甲醇提取液：取0.1 mol·L-1盐酸80 mL，加入甲醇20 mL，混匀。

饱和醋酸铅溶液：50 mL水中加入适量的醋酸铅，超声5 min，直至固体不再溶解。

5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水，用甲醇稀释至100 mL。

0.2 %甲酸水溶液：取甲酸1 mL，加水定容至500 mL。

1.3 液相色谱-质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Thermo scientific BDS Hypersil C18（2.4μm，100 mm×2.1 mm）；流动相为甲醇（A）和0.2%甲酸水溶液（B）；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：4μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序：开始时20%A，3 min 80%A；3.0~5.5 min 80%A；5.6 min 20%A；5.6~10.0 min 20%A。分析总时间为10 min。

1.3.2 质谱条件

离子源：ESI电喷雾离子源；扫描方式：正离子；检测方式：多反应监测；干燥气温度：350℃，流速：10 L·min-1，雾化器压力：276 kPa，鞘气流速：11 L·min-1，鞘气温度：250℃，毛细管电压：3.5 kV，碰撞气体为氮气。福莫特罗和阿福特罗的质谱参数见表1。

表1 福莫特罗和阿福特罗的质谱参数

1.4 样品前处理条件

称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，分别准确加入福莫特罗-D6内标工作液100μL、19 mL盐酸甲醇提取液和1 mL饱和醋酸铅溶液，摇匀，充分振荡20 min，于7 000 r/min离心10 min，取上清液作为备用液。

将固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，准确移取5 mL备用液过柱，依次用2 mL水、2 mL甲醇淋洗，真空抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，40℃条件下旋转蒸发至干或50℃氮吹至干，用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，过0.22μm滤膜后上机测定。若试样液中含有的待测物浓度超出线性范围，进样前可用一定体积的0.2%甲酸水溶液稀释，使其浓度在线性范围内。

2 结果与讨论

2.1 样品提取溶剂和净化条件的确定

福莫特罗和阿福特罗微溶于水，几乎不溶于乙腈，溶于甲醇。根据其在不同试剂中的溶解性，试验分别选取甲醇、盐酸甲醇、乙酸铵甲醇作为提取溶剂，对添加浓度为1.0 mg·kg-1的乳猪配合饲料样品进行测定，根据仪器响应值确定最佳提取溶剂。结果表明，使用盐酸甲醇作为提取溶剂时，回收率最高，色谱峰干扰杂质少，提取液中加入的饱和醋酸铅能有效沉淀样品中的蛋白和脂肪，达到了提取和部分净化的要求。提取液中甲醇比例仅为20%，其价格低廉易得，对操作人员危害小，溶剂更加安全环保。酸性的提取液使碱性待测物呈离子化状态，既可增强其溶解性，又利于净化中与萃取柱进行离子交换保留，提高提取回收率。

饲料普遍本底复杂，可能含有动物蛋白、植物蛋白、色素及多种矿物元素。福莫特罗或阿福特罗在配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中使用剂量不同，因此试验分别对各类饲料样品进行了净化条件的研究。选取实验室常见的十八烷基硅胶（C18）、混合型阳离子（MCX）、亲脂亲水性（HLB）固相萃取柱分别考察其对标准物质的保留性以及添加浓度为1.0 mg·kg-1的乳猪配合饲料、猪浓缩饲料、猪复合预混合饲料样品的回收率。结果表明MCX柱对不同饲料样品的净化效果最理想，特别是对于含矿物元素较高的添加剂预混料的回收率较高。由福莫特罗和阿福特罗结构式可知，其属于弱碱性化合物，MCX混合型阳离子固相萃取柱具有反相和阳离子交换双重保留性能，对离子化的弱碱性化合物保留能力强，绝对回收率高。因此，本试验最终选择MCX萃取柱为净化柱，结合超高效液相色谱-串联质谱仪高分离能力、高选择性、高灵敏度等特点。该方法可适用于实验室大批量样品检测。

2.2 色谱条件的确定

若要分别测定福莫特罗和阿福特罗的含量，首先应将外消旋体分离。目前外消旋体的拆分方法主要有不对称催化合成、Chiron方法、色谱法等[17]，其中在检测分析中以色谱法居多，主要通过引入手性环境或将外消旋体转变为理化性质差异显著的非对映异构体来实现手性分离[18]。目前色谱法分离对映体主要采用手性色谱柱，固定相主要包括多糖、环糊精、冠醚等[19]，这些固定相与对映体间可能存在静电、氢键、π-π、偶极-偶极等作用，进而实现外消旋体的拆分。手性色谱柱售价一般是普通色谱柱的2~3倍，且流动相的pH值和柱温对分析结果影响显著，目前尚无一种普遍适用的手性柱，因此给手性化合物的分离造成极大的困难。福莫特罗和阿福特罗均为国家规定的在养殖环节禁止使用的化合物，因此只要在饲料中检出两者中任何一种物质即判定为非法添加物。为使方法具有可操作性和实用性，本试验选用检测机构普遍采用的C18色谱柱对福莫特罗和阿福特罗的总量进行测定，极大节约了检测成本，可实现与β-受体激动剂其他物质的同时检测。

根据待测物理化性质，分别选用甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水溶液、甲醇-50 mmol·L-1乙酸铵水溶液作流动相，其他条件同“1.3”所述，对质量浓度为20 ng·mL-1的标准品及内标物进行测定，以色谱峰的响应值和分离效果为评判依据，确定最佳流动相比例。结果表明，采用甲醇-0.2%甲酸水溶液作流动相时的信号响应值最高，分离效果满意，试验结果与农业行业标准[20]一致。在质谱正离子模式和电喷雾离子源条件下，流动相中添加一定量的甲酸不仅能提高待测物的离子化效率，而且有利于色谱峰形的改善，从而提高方法的灵敏度，因此本方法选其作为流动相。

2.3 定性和定量离子对的确定

在质谱仪正离子模式下，可不安装色谱柱，直接将液相色谱与质谱用两通连接，将0.5μg·mL-1的福莫特罗、阿福特罗标准溶液以及福莫特罗内标物分别进行母离子扫描，确定各化合物的分子离子峰，并优化其锥孔电压。将上述分子离子作为母离子，在碰撞气体和适当碰撞能量的作用下对其进行子离子全扫描， 选取两组丰度最高、质荷比大、干扰较小的子离子，将丰度较高的作为定量离子，次之的作为定性离子。将上述母离子和两组子离子组成监测离子对并进行多反应监测。该监测离子对为待测物的质谱检测条件，满足欧盟2002/EC/657对质谱定性4个识别点的指令要求，即1个母离子为1.0个识别点，2个对应的子离子为2×1.5个识别点。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

精密量取适量福莫特罗或阿福特罗标准工作液，用0.2%甲酸水稀释定容，制得1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1各系列工作溶液，内标物浓度均为25 ng·mL-1，供高效液相色谱-串联质谱测定。以待测物峰面积与其内标物峰面积的比值为纵坐标，以待测物浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明待测物在1.0~100 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=0.040 8x-0.007 4，相关系数R2=0.999 9。

添加适量标准溶液于空白样品中，按照1.4和1.3要求进行前处理和测定，依据待测物信噪比S/N>3和S/N>10分别确定方法检出限（Limit of de⁃tection，LOD）为0.01 mg·kg-1和定量限（Limit of quantity，LOQ）为0.05 mg·kg-1。本方法定量分析采用内标法校正，消除了样品基质对测定结果的影响，保证了检测结果的准确性和实验操作的重现性。

2.4.2 方法选择性

猪配合饲料和标准溶液特征离子色谱图见图1~图3。

图1 空白猪配合饲料特征离子色谱图

图3 福莫特罗、阿福特罗及内标物（20 ng·mL-1）特征离子色谱图

图2 空白猪配合饲料添加回收（0.5 mg·kg-1）特征离子色谱图

分别选取猪配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料进行方法定量限浓度添加回收试验，由试验结果可知，待测物色谱峰杂质干扰少，响应信号强，满足测定的要求。

另外，试验考察了福莫特罗和阿福特罗的同分异构体苯乙醇胺A对测定的干扰[12]，多反应监测色谱图见图4。虽然苯乙醇胺A的母离子和其中一个子离子与福莫特罗完全相同，但在现有色谱条件下，两个化合物实现了完全的分离，苯乙醇胺A不会对福莫特罗的测定结果产生干扰。

图4 苯乙醇胺A与福莫特罗特征离子色谱图

2.4.3 回收率与精密度

为进一步考察方法的准确性和精密度，选取空白猪配合饲料和鸡配合饲料在0.05、0.10、1.00 mg·kg-1水平下进行加标回收试验；选取空白猪浓缩饲料和空白鸡浓缩饲料分别在0.05、1.00、10.00 mg·kg-1水平下进行加标回收试验；选取空白猪复合预混料在0.05、1.00、20.0 mg·kg-1水平下进行加标回收试验。每个添加浓度制备5个平行样品，重复3个批次，准确度和精密度见表2。结果表明，实际样品的批内和批间回收率为75.6%~91.4%，批内和批间相对标准偏差均小于9%。说明本方法准确度和精密度良好，符合实验室质量控制规范要求[19]，适用于各类饲料中福莫特罗和阿福特罗总量的定性和定量检测。

表2 方法的加标回收率和精密度测定结果

2.5 方法的应用

用本方法对四川省内生产环节和使用环节中的各类饲料产品进行福莫特罗和阿福特罗的测定。地域涵盖四川省东、西、南、北部8个地级市的饲料生产企业和养殖场户共计68份样品，测定结果均是未检出。原因可能是采集到的饲料中未添加福莫特罗和阿福特罗，但不排除养殖场户为追求高额利润，通过其他途径违规使用，例如饮水、肌肉注射或小范围拌料。因此，可通过增加监测范围和样本数量，扩大采样途径，从而更加科学系统地评价饲料中福莫特罗和阿福特罗的风险隐患。

3 结论

本研究利用实验室普遍采用的十八烷基硅烷键合硅胶柱建立了一种灵敏度、准确度和精密度良好的超高效液相色谱-串联质谱测定饲料中福莫特罗和阿福特罗总量的方法。样品提取液有机相含量低，减少了对操作人员的伤害，步骤科学合理，易于操作，使用内标法定量，增强了方法的准确性，为保障饲料及食品质量安全具有重要意义，值得推广和借鉴。