一株厌氧反硝化细菌的分离鉴定与砷耐受功能研究

冯纪龙，陈晓明，刘紫薇，罗 锋

(1.中国地质大学(武汉)环境学院，湖北 武汉 430078；2.江汉大学医学院，湖北 武汉 430056)

砷(As)是一种类金属元素，有很强的毒性，广泛存在于地壳与生物圈。它的氧化物——三氧化二砷(AsO)，就是俗称的“砒霜”。我国作为粮食生产大国，土壤中的砷却严重超标，而稻米吸收土壤中的砷，导致砷进入人体造成一系列的健康问题。我国砷超标大米占全国总量的1%左右，全国有60%地区以食用稻米为主。据报道，稻米对砷的吸收能力比其他农作物及蔬菜高很多，在砷污染比较轻的地区，水稻中的砷从茎叶到稻米的转移系数比小麦和其他作物高10倍左右。在高砷的环境下，一部分微生物为了维持正常的生命活动，进化出耐砷机能，一些微生物能够通过自身生化作用将毒性很强的砷排出体外而进入环境中。微生物对砷的耐受机制主要与砷的吸收、氧化还原、甲基化和外排等作用相关。砷的抗性主要由 arsC 操纵子操控。原核生物的砷抗性研究显示，砷的抗性主要由3个基因来调控。微生物对三价砷[As(Ⅲ)或As]的氧化由砷氧化酶基因(aioA/aioB)调控，对五价砷[As(Ⅴ)或As]的还原由细菌的砷还原酶基因(arr/arsC)调控。

第三步：2NO+2H+2e→NO+HO

第四步：NO+2H+2e→N+HO

稻米和蔬菜是人体摄入的主要食物来源，由于人的活动造成了稻米和蔬菜中砷与硝酸盐超标。当人体长期摄入砷与硝酸盐时，会造成机体的严重损害。砷污染稻米与硝酸盐超标蔬菜会经过人体的消化道被胃肠道吸收并释放部分砷与硝酸盐产物，人体肠道对砷与硝酸盐具有一定的解毒作用，肠道微生物发挥着重要的作用。砷在人体肠道内各个阶段的价态和比例各不相同，人体肠道微生物群落结构在各个时期也不相同。人体肠道微生物群落对硝酸盐的还原途径主要有两种：一种是通过硝酸盐异化作用还原为铵；另一种是通过反硝化作用转化为N。

目前关于硝酸盐在人体肠道中的还原机制研究已经取得了很大的进展，但是对于具有特点的硝酸盐还原单株菌报道还很少见。因此，本试验通过富集与分离方法得到单株

Escherichia

CD14-2，研究了此单株菌的反硝化速率，并对其耐砷作用进行了探究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

用粪便采样器(Longsee菌群采样器)和灭菌药勺采取人体新鲜粪便样品。志愿者是来自于非砷污染地区且6个月没有抗生素治疗史的一名健康女性。粪样为晨便中段约3～4 cm处。

1.1.2 培养基

脑心浸液培养基(BHI)(g/L):脑心浸液17.5 g，D-葡萄糖2.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸二氢钠2.5 g，琼脂(选择添加)15.0 g，去离子水1 000 mL。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,氯化钠10 g，去离子水950 mL，琼脂(选择添加)15.0 g。

DM培养基(g/L)：硝酸钾0.72 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁1 g，琥珀酸钠2.8 g，去离子水1 000 mL。

改良后矿物盐培养基(3M培养基)(g/L)：十二水磷酸氢二钠7.56 g，磷酸二氢钾3 g，七水硫酸镁0.3 g，氯化钾0.5 g，氯化钙0.01 g，微量元素溶液，维生素溶液，去离子水1 000 mL。

上述培养基均在121℃、1×10Pa条件下，灭菌30 min备用。

1.2 试验方法

1.2.1 肠道微生物中反硝化细菌的富集

1.2.2 耐砷反硝化细菌的分离与纯化

1.2.3 菌株的形态学鉴定

观察菌株的形态、大小和颜色，进行革兰氏染色，并结合《伯杰细菌鉴定手册》进行形态特征鉴定。

1.2.4 菌株的16S rRNA和narG功能基因的鉴定及系统发育树分析

采用煮沸法提取菌株的DNA作为模板，使用16S rRNA基因PCR通用引物进行扩增。正向引物为27F，反向引物为1541R。其碱基序列分别是5-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3和5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。反应体系为(50 uL)：ddHO 38.75 μL， 10×PCR 缓冲液5 μL，dNTPs 1 μL，27F和1541R各1 μL，Taq polymerase 0.25 μL，DNA模板3 μL。16S rRNA反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃复性30 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸7 min。

将PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，并将PCR产物送至武汉天一辉远公司进行测序。

用菌株DNA作为模板，对菌株的功能基因——硝酸盐还原酶基因进行扩增。PCR引物选用墨西哥科学家Rocio等设计的两对引物：

napAf1:5-CTGGACIATGGGYTTIAACCA -3

napAr1:5-CCTTCYTTYTCIACCCACAT-3

narGf1:5-ICAYGGIGTIAACTGYAC-3

narGr1:5-TCGSMRTACCAGTCRTARAA-3

两对引物napA和narG期望的PCR片段长度在500 bp左右，引物由武汉天一辉远公司合成，得到目的条带后进行胶回收[DNA胶回收试剂盒QIAquick® Gel Extraction Kit(50)]，然后进行连接转化试验，并挑取含有重组质粒的阳性菌落进行菌液PCR鉴定。菌液PCR引物为通用引物RV-M和M13-47。将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并将电泳条带在500 bp左右的菌液送至武汉天一辉远公司进行测序。

1.2.5 测定菌株对不同碳源的利用情况和不同砷浓度下的反硝化能力

1.2.6 测定方法与数据分析

采用紫外分光光度法(BHJ/T 346—200)测定样品中硝态氮(NO-N)含量；采用N-(1- 萘基)- 乙二胺二盐酸盐分光光度法(GB 7493—87)测定样品中亚硝态氮(NO-N)含量；采用纳氏试剂分光光度法(GB HJ535—2009)测定样品中铵态氮(NH-N)含量；使用pH仪测定样品的pH值；采用原子荧光光谱法(AFS)测定样品中砷含量。

图和表使用Origin 9.5和Excel绘制；使用Photoshop CC2015 编辑图片；系统发育树使用 MEGA 7.0完成制作。

2 结果与分析

2.1 反硝化细菌的富集、分离与纯化

利用BHI培养基进行富集，DM培养基和LB固体培养基进行分离与纯化，用3M培养基测试分离纯化出来的细菌功能，得到一株反硝化细菌CD14-2。该菌株能将10 mM NO-N转化为大约9 mM NO-N，转化率可达到90%，期间不产生铵态氮。

2.2 菌株的形态学鉴定和系统发育树建立与同源性分析

菌株CD14-2在LB固体培养基上的形状为圆形，颜色为乳白色，微微隆起，单菌落直径大概在2～3 μm，表面光滑有光泽且有一定的黏性，见图1。该菌株革兰氏染色为阳性，光学显微镜下观察为细小短杆型。将得到的单菌落用LB培养基扩大培养，培养24 h后吸取1 mL菌液，利用煮沸法提取菌株CD14-2 的DNA，然后将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，得到条带在1 500 bp 左右。通过测序得到菌株CD14-2的16S rRNA基因序列，并在NCBI上Genbank数据库进行BLAST序列比对与分析，结果发现该菌株属于变形菌门，肠杆菌科，埃希氏杆菌属(CD14-2基因序列与埃希氏杆菌(

Escherichia

fegusonii

)序列相似度达到了98.43%)，将其命名为

Escherichia

sp.CD14-2。使用邻接法构建菌株

Escherichia

sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系统发育树，见图2。将菌株

Escherichia

sp.CD14-2的16S rRNA基因序列提交Genbank，获取Genbank登录号为MT883284。

图1 菌株Escherichia sp.CD14-2 平板

图2 菌株Escherichia sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系统发育树

通过试验发现菌株

Escherichia

sp.CD14-2具有反硝化作用，能够将硝酸盐转化为亚硝酸盐。于是对其反硝化过程的第一步关键酶——硝酸盐还原酶基因narG和napA进行扩增和测序(napA扩增未成功)。根据菌株

Escherichia

CD14-2的narG基因编码的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST序列对比与分析，结果发现其同源性最近的是

Escherichia

coil

(大肠杆菌)，相似度达到了98.18%。使用邻接法构建菌株

Escherichia

sp.CD14-2功基于narG同源性的系统发育树，见图3。

图3 菌株Escherichia sp.CD14-2基于narG同源性的系统发育树

2.3 菌株Escherichia sp.CD14-2 的反硝化功能

在新鲜粪便中分离出的肠道微生物单株

Escherichia

sp.CD14-2 是一株反硝化细菌，但是其只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐并大量累积。本试验探究了菌株

Escherichia

sp.CD14-2在乳酸钠作为碳源下的反硝化能力，其试验结果见图4。

图4 菌株Escherichia sp.CD14-2在乳酸钠作为碳源下的反硝化速率

在含有乳酸钠作为碳源的培养基中，菌株

Escherichia

sp.CD14-2 能够在2 d内将10 mM硝酸盐氮还原为 9 mM亚硝酸盐氮，还原率达到 90%左右；而在其他有机碳源下，该菌株还原硝酸盐的能力较弱，当加入无机碳源碳酸氢钠时，菌株

Escherichia

sp.CD14-2的反硝化能力很弱，在一周内才生成1 mM左右的亚硝酸盐。

2.4 菌株Escherichia sp.CD14-2对不同碳源的利用情况

将菌株

Escherichia

sp.CD14-2接种到添加有不同碳源的培养基中，结果发现：在含有甲酸钠或甲醇的培养基中细菌几乎不具有反硝化功能，在含有碳酸氢钠或柠檬酸钠的培养基中该菌株反硝化功能较弱，而在含有乳酸钠或丙酮酸钠或葡萄糖的培养基中，该菌株生长非常迅速且反硝化功能很强。菌株

Escherichia

sp.CD14-2对不同碳源的利用情况，见表1。

表1 菌株Escherichia sp.CD14-2对不同碳源的利用情况

菌株分离自新鲜粪样，属于肠道微生物。肠道微生物能够利用多种碳源为机体和菌株本身提供生长所需要的能量，菌株

Escherichia

sp.CD14-2的分离纯化说明肠道微生物具有硝酸盐还原的能力。如果外部的硝酸盐浓度过高对机体可能产生严重的危害。

2.5 菌株Escherichia sp.CD14-2的耐砷功能

对于反硝化细菌

Escherichia

sp.CD14-2的耐砷功能的探究，可在不同三价砷浓度下检测菌株

Escherichia

sp.CD14-2的OD值来测定该菌株的生长曲线，见图5。

图5 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同三价砷浓度下的生长曲线

由图5可见，在LB培养基中，该菌株在无砷条件下OD值达到0.8左右，在添加1 mM As(Ⅲ)的情况下其OD值略小于不加入外源砷，而继续增加外源砷浓度时，该菌株的生长受到抑制。

2.6 不同砷浓度下菌株Escherichia sp.CD14-2的反硝化能力

在测定不同砷浓度下菌株

Escherichia

sp.CD14-2的反硝化能力时，选用改良的矿物盐培养基(3M)作为培养基，乳酸钠作为有机碳源,其试验结果见图6。

图6 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同砷浓度下硝酸盐氮的还原和亚硝酸盐氮的生成曲线

3 结 论

(1) 本试验采用健康女性的粪便，通过分离与纯化得到反硝化细菌CD14-2，经形态学分析鉴定其为革兰氏阴性菌，16S rRNA基因序列分析得出其与

Escherichia

fegusonii

相似性达到98.43%，确定该菌株为埃希氏杆菌属，并命名为

Escherichia

sp.CD14-2。该菌株的硝酸盐还原功能与narG基因相关。(2) 本试验检测了菌株

Escherichia

sp.CD14-2对不同碳源的利用情况，结果发现该菌株能够快速利用葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠等碳源，对于甲酸钠和甲醇几乎不能利用或者利用缓慢。(3) 砷对菌株

Escherichia

sp.CD14-2的生长具有抑制作用，且砷浓度越大其抑制效果越强烈。此外，在不加砷和外源砷浓度在1 mM的情况下菌株

Escherichia

sp.CD14-2能够在48 h内将10 mM的NO-N还原成8.0 mM NO-N并且大量累积；在加入5.0 mM的外源砷时，菌株

Escherichia

sp.CD14-2能够在48 h内将10 mM的NO-N还原成6.0 mM NO-N，高砷对其生长具有抑制作用。(4) 本试验对富集分离出的菌株

Escherichia

sp.CD14-2 的反硝化能力及其耐砷功能的研究，说明人体肠道内具有砷抗性微生物，当人体摄入少量砷时，肠道微生物可能具有一定的解毒功能。