基于硬组织微化学技术的头足类洄游特征研究进展

韩霈武，王 岩，方 舟,2,3,4,5，刘必林,2,3,4,5，陈新军,2,3,4,5

（1.上海海洋大学海洋科学学院//2.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室//3.国家远洋渔业工程技术研究中心//4.农业农村部大洋渔业开发重点实验室//5.农业农村部大洋渔业资源环境科学观测实验站，上海 201306）

头足类是海洋渔业重要经济物种，广泛分布于世界各大海域[1]。头足类为典型的短生命周期物种[2]，极易受到周边海域环境的影响，不同生活史阶段有着不同的栖息规律，因此多数具有明显的洄游行为[3]。研究头足类洄游路线和生境分布，对了解头足类生活史过程、合理指导开发其资源有很大帮助。目前，外部标签标记-重捕（tag-recapture）和电子标记（electronic tagging）方法是研究头足类迁移最常用的两种技术[4]。但这两种技术存在较明显缺陷。外部标签标记-重补的成功率较低，而电子标记会受到监测设备的影响[4]。

近年来，随着微化学技术的不断发展，微量元素（trace element）与稳定同位素（stable isotope）分析已广泛应用于头足类分布规律和洄游特征研究[6-7]。头足类的硬组织，如耳石、角质颚、眼睛晶体、内壳，有着稳定的形态特征和连续生长纹，包含丰富的生态信息，能够连续记录头足类整个生活史的环境历程，是研究头足类分布和洄游特征的良好材料。通过微化学技术来研究头足类硬组织中所包含的重要信息，可以为研究物种的分布规律和洄游提供参考依据。因此，本研究基于前人采用微化学技术针对头足类硬组织开展的相关研究，系统综述头足类分布规律和洄游特征进展情况，旨在为国内开展此类相关研究提供理论参考。

1 微化学技术

1.1 微量元素

头足类在与外界栖息环境进行能量交换的过程中，环境中一些元素通过呼吸、摄食和血液循环等方式进入体内，这些元素在体内递减传输，最后以较少含量沉积在耳石等硬组织中，称其为微量元素[8]。因此，硬组织中的微量元素含量与其生活环境中含量有着一定联系[9]。通过周围水环境和硬组织微量元素的相关信息分析，可以推测个体的洄游信息[10]。利用硬组织微量元素推测头足类洄游分布的方法原理一般为：利用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪（LA-ICP-MS）或电子显微探针元素分析技术（EPMA）等仪器设备，将研磨后的硬组织按其历史生长基线，测定不同生长阶段的微量元素，以微量元素与钙比值[11]（如Sr/Ca）或通过其它微量元素[12]（如Na、P、Zn）等方式，建立起研究个体从硬组织切面核心区（胚胎期）至边缘区（死亡）的整个生活史时间序列的元素分布模式，并根据研究对象的年龄和捕获日期推算其孵化日期[13-14]。利用孵化至捕获期间不同时间段的水域温度、盐度等环境变量与硬组织元素特征之间的关系[15]，推测个体不同生活史阶段所对应的高/低温度、高/低盐度、高/低元素浓度等环境因子对应栖息水域的可能性，通过对应水域的季节性特征来判断不同时期洄游范围概率[16]，从而模拟出研究个体的洄游路径。

1.2 稳定同位素

稳定同位素分析具有示踪和指示等多项功能，以及检测快速、结果准确等特点[17]，用来研究头足类的营养路径和迁移模式。以往，稳定同位素的研究主要集中在C 和N 上[18-20]。目前，除此之外，其它一些稳定同位素（如O、Sr）也逐渐得到广泛应用[21-22]。硬组织是头足类的时间记录器，对其进行稳定同位素分析，可以重建个体整个生命周期的摄食、栖息地和洄游路线[23]。利用硬组织稳定同位素推测头足类洄游分布的方法原理一般为：硬组织中的一些稳定同位素能够反映栖息水域的食物网[24]，不同栖息水域食物网中的稳定同位素含量具有空间差异性。个体在不同水域之间移动，经历同位素不同的食物网，并保留了每一时期摄食位置信息[16]。这些信息依赖于硬组织对化学元素的转化效率，通过同位素比例质谱仪（IR-MS）等仪器设备分析硬组织不同部位稳定同位素含量[25]，将分析结果与水体中相应的稳定同位素含量进行比较，推测个体可能出现的区域位置[16]。

2 硬组织在洄游中的研究

2.1 耳石微化学在洄游中的研究

耳石是头足类重要硬组织，对其起着重要生理作用，具有接受声音和平衡定向的功能[26-27]，由约96%碳酸钙、3%蛋白质和1%微量元素组成[28]。耳石常被用于头足类年龄与生长[29-31]、种群划分[32-33]等方面研究。近些年来，随着微化学技术不断发展，基于耳石微量元素和稳定同位素等微化学成分的分析已成为研究和分析生活史、洄游路径等的一种新兴手段[34]。

2.1.1微量元素 耳石生长贯穿头足类整个生命历程，且耳石是一种非细胞组织，具有惰性代谢功能，一旦沉积，其成分不会被重吸收或改变[35-37]。因此，沉积在耳石上的环境元素能够很好地保存下来，从而永久地记录个体生活史中各阶段的环境状况[38-39]。通过耳石中的微量元素含量及比值，并与环境因素建立关系，可模拟出其经历的洄游环境，从而推测其洄游路径。

迄今为止，在耳石中已测量出50 多种元素[6]，其中耳石元素Sr、Ca 含量的变化常被用来作为反演不同盐度水境的指标[6,10]。不同自然水体间Sr 含量也存在着显著的差异，淡水区含量低，海水区含量高，河口区介于两者之间[10,40]，现有较多的研究表明耳石中Sr/Ca 的大小与水体盐度存在正相关关系[41-42]，因此，Sr/Ca 被广泛应用于头足类在不同盐度水域之间的洄游推测。耳石中的Sr 含量（等同于Sr/Ca）与水温也密切相关，与水温呈负相关关系[43-45]。Yatsu 等[46]根据北太平洋柔鱼（Ommastrephes bartramii）耳石纵切面的Sr/Ca 变化，发现耳石核心区和背区外围附近的Sr/Ca 明显高于中部区域（距离核心区270～ 420 μm），呈U形分布，并认为这与北太柔鱼在产卵场（副热带）到索饵场（亚北极区）间经历的季节性洄游有关。Yamaguchi 等[47]通过耳石中Sr/Ca 变化趋势推测其生活水温，并结合剑尖枪乌贼（Uroteuthis edulis）栖息水层，推测出日本海捕捞的剑尖枪乌贼的洄游路径，即剑尖枪乌贼的孵化场在东海南部，而日本海南部则是其索饵场。

除Sr、Ca 元素的研究外，耳石中诸多微量元素也得到广泛应用。这些元素，例如钡（Ba）、钠（Na）、锰（Mn）、锌（Zn）和镁（Mg），同样记录着栖息环境信息，因此，可以利用这些元素之间的差异性进行洄游路线的研究[4]。Ching 等[48]通过对不同群体莱氏拟乌贼（Sepioteuthis lessoniana）的9 种微量元素进行分析，发现两个群体间微量元素浓度差异显著，并结合环境因素，推测其有着不同洄游路线。Liu 等[14]利用海表温（Sea surface temperature,SST）和耳石元素特征之间关系，成功建立了东南太平洋智利专属经济区内的茎柔鱼（Dosidicus gigas）从稚年期到成年期的洄游路线，发现茎柔鱼稚鱼期生活在智利北部沿岸海域，1 月下旬向南洄游至智利中部沿岸海域，2 月向西洄游，9－11 月向北洄游。

2.1.2稳定同位素 耳石中的同位素成分被认为是运动生态学研究中历史环境的自然指纹，记录着外界环境信息[49-50]。目前，耳石的稳定同位素主要集中在C、O、Sr 等同位素研究上[51-53]。耳石主要成分是CaCO3，故其中C 和O 元素的稳定同位素组成被广泛利用为研究工具。其中，C 同位素与水环境中的多种代谢源的同位素成分密切相关，并能够影响着头足类的新陈代谢、摄食和营养级[54-56]；O 同位素与水环境中的氧同位素保持着一种平衡（或接近），并且与水温有关[57-59]，可以作为水体温度的指示剂[60]。另外，Hobbs 等[61]发现耳石中的Sr 同位素比值（87Sr/86Sr）能够反映栖息地的水域特征，且耳石中Sr 同位素比值与水环境之间呈正比，因此Sr 同位素组成可以有效地反应头足类的迁移过程，并重建其生活环境史[62-63]。目前，这种方法已应用于裸鲤（Gymnocypris przewalskii）[64]、金枪鱼[65]等鱼类洄游中，而在头足类洄游中的应用报道较少。

2.2 角质颚微化学在洄游中的研究

角质颚位于头足类口球内，由上颚和下颚两部分组成，是头足类重要摄食器官，具有良好信息储存功能。其形态结构稳定，不易腐蚀，这样的结构能够使其不被捕食者消化，具有良好指示作用。近年来，随着微化学技术不断发展与创新，基于角质颚微化学的研究，逐步受到国内外学者关注[66-68]。

2.2.1微量元素 头足类角质颚是由丁几质和蛋白质组成，具有非细胞性和代谢惰性，随着头足类与角质颚的同步生长，环境中一些元素会逐步沉积在角质颚中，并能永久保存下来。因此，角质颚中某些元素能够反映头足类不同生活史阶段的环境状况[67]，通过测定角质颚中微量元素，并结合环境数据，从而推测头足类洄游路径。Northern 等[69]对强壮桑椹乌贼（Onykia ingens）角质颚的微量金属元素进行了测定，共发现23 种元素，其中Na、K、P、Ca、Mn、B 和Zn（都是海水中主要的元素）占总体元素的99%以上。研究结果表明，角质颚中微量元素能够客观反映乌贼栖息地的环境，从而指示出物种的地理位置。Fang 等[12]对北太平洋柔鱼（O.bartramii）角质颚微量元素进行逐步线性分析，筛选出Na、P、Zn三种微量元素与SST 的关系最为密切，通过建立这三种微量元素与捕捞点环境数据（SST）的关系，找到不同生活史阶段最适合的SST，并使用贝叶斯方法推测出不同生活史时期个体出现最大概率的海域，从而模拟推测出北太柔鱼冬春生群体的洄游路径。

2.2.2稳定同位素 目前，对于头足类角质颚的稳定同位素研究主要集中在C 和N 同位素上。在海洋环境中，δ13C 可以指示生物个体在较低或较高纬度、近岸或远洋、表层或底层的摄食信息[70-71]，δ15N 则指示生物个体所处的营养级水平[19-20]。因此，可以通过头足类不同时期角质颚中δ13C 和δ15N 的变化，来了解其食物来源和营养级变化，从而推测其洄游路径。Hobson 等[72]发现角质颚的喙顶部（rostrum）、侧壁（lateral wall）、翼部（wing）分别代表了头足类生活史早期、中期和近期的食物信息。而角质颚翼部顶端形成较晚，因此其中稳定同位素反映其被捕获或死亡之前所消耗食物的信息[67]，由此变化可以了解头足类整个生活史中的摄食生态信息，从而了解大致的洄游路径。Guerra等[73]对大王乌贼（Architeuthis dux）上角质颚喙部顶端向后（生长方向）每1.45 mm 取样1 次，运用同位素比例质谱仪（IR-MS）测定C 和N 稳定同位素，根据δ13C 和δ15N 组成的变化表明，大王乌贼在生命早期进行短暂的洄游行为，成年后在一个相对较小的区域内移动。Golikov 等[74]通过对黵乌贼（Gonatus fabricii）角质颚中δ13C 和δ15N 值的分析，发现格陵兰岛西部和东部水域以及巴伦支海的黵乌贼为避免捕食压力，在成长过程中，逐步向更深水层移动。李建华等[75]利用IR-MS 法初步了解哥斯达黎加茎柔鱼（D.gigas）角质颚稳定同位素δ13C 和δ15N 的含量，通过分析不同个体大小、不同年龄角质颚的稳定同位素变化，揭示在生长过程中，哥斯达黎加外海茎柔鱼由大陆架向大洋的洄游过程。Queirós 等[76]对伯德岛阿根廷滑柔鱼（Illex argentinus）下角质颚喙顶部和翼部进行取样分析，通过研究其δ13C 和δ15N 的变化，发现阿根廷滑柔鱼随着年龄生长，向北或向近海移动。Liu 等[77]根据秘鲁专属经济区内海域采集的茎柔鱼（D.gigas），通过同位素比例质谱仪（IR-MS）测定其角质颚中δ13C 和δ15N 的变化，并运用广义加性模型（generalized additive model,GAM）进行分析，结果表明角质颚中δ13C 和δ15N 值变化范围较广，说明在生长过程中，秘鲁茎柔鱼存在大规模的洄游行为。

2.3 眼睛晶体微化学在洄游中的研究

眼睛晶体是头足类重要视觉器官，由前后两个半球组成，主要是由水和蛋白质构成[78]，用于辅助捕食和躲避敌害[79]。眼睛晶体是一个作为替代耳石、角质颚的又一硬组织材料，可用于微化学分析，这种组织在其形成和功能方面已得到广泛研究，但是使用眼睛晶体重建生活史、洄游路径的潜力还在初步评估中[23]。

2.3.1微量元素 眼睛晶体与其它硬组织不同，它们之间微量元素含量有着较大差别。Pourang 等[80]对鱼类不同部位（耳石、鳞片、眼睛、背鳍、鱼椎骨、肌肉、肝脏）的13 种微量元素（Br、Ca、Cl、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、S、Sr、Zn）进行测定，发现在所有硬组织中，除眼睛晶体外，Ca是最丰富的元素，Fe 是最少的元素，并且在眼睛晶体中Ca 含量极少。Gillanders 等[78]通过对鱼类四种结构（耳石、眼睛、鳍条、鳞片）进行微量元素测定分析，发现在眼睛晶体中并没有检测到Ca，并且Sr 含量极低。Tzadik 等[23]研究认为眼睛晶体的钙化程度基本为零，不适合用于微量元素分析。尽管如此，眼睛晶体中还是存在着许多微量元素，并且与其它硬组织相比，仅能在眼睛晶体中检测出Hg 元素，这可以作为头足类耳石微量元素研究的一个有利补充[78]。Dove 等[81]认为，眼睛晶体中微量的富集与空间变化有关，并发现眼睛晶状体的微量元素可能适合于种群划分。Kingsfor 等[82]认为，眼睛晶体微量元素的变化与水深也有一定关系。目前，尚未见到眼睛晶体微量元素在头足类洄游中应用的报道。

2.3.2稳定同位素 眼睛晶体中含有大量的蛋白质，其蛋白质占眼睛晶体体质量的50%[83]，因此适合用于碳（δ13C）氮（δ15N）稳定同位素的分析[84]。眼睛的晶体记录着整个生命周期的同位素[23,85]。随着个体生长，新的眼睛晶体层在晶体外侧依次形成[86-87]。在新层形成的初始阶段，新层产生的蛋白质反映了环境中同位素比值[88]。然而，新层最终的形成涉及到细胞的死亡，使得蛋白质不再更新。细胞的死亡通过消除光散材料改善了新层的光学性质，阻止了新的蛋白质形成，但获得了与新层形成有关的同位素。同样，下一个层的形成反映了下一个时期的环境同位素条件。因此，眼睛晶体中每一个层所包含的稳定同位素信息都代表着一个时期的环境信息。通过对这些层的剥离（分层）和分析，从而重建生命周期的同位素历史[89]。Brenna 等[90]利用眼睛晶体中碳氮同位素比值的变化，对西佛罗里达大陆架的普氏枪乌贼（Doryteuthis plei）的洄游模式进行研究。结果表明，这些鱿鱼沿着大陆架叶绿素最大值处开始生活，并随着年龄增长向近岸移动。Onthank 等[91]对茎柔鱼（D.gigas）眼睛晶体的δ13C 和δ15N 进行分析，发现茎柔鱼个体间的碳和氮稳定同位素记录变化很大，这表明即使在近距离采集的茎柔鱼也有不同的迁移历史，同时，根据眼睛晶体核心层较低的δ13C 推测其孵化地在37°N 以北。

2.4 内壳微化学在洄游中的研究

内壳是头足类又一重要的硬组织，具有支持身体的功能[92]。同其它硬组织一样，内壳生长也具有不可逆性，且贯穿整个生活史过程，从而记录着头足类生活史的全部信息[93]。

2.4.1微量元素 同其它硬组织一样，内壳中微量元素的数量分布和空间分布会受到海水中微量元素的影响，通常反映化学、物理和生物环境的变化，记录着头足类生活史信息。Doubleday 等[94]对澳大利亚苍白蛸（Octopus pallidus）的内壳进行微量元素测定，检测到内壳各断面的Ca、Sr、Zn、Fe、Br、Mn 和Cu 的含量较高，Co、Rb、As、Ni 和Ba 的含量较低，并发现一些元素浓度（如 Ca、Sr、Mn 和Ni）在个体成年期和孵化期之间存在差异，另一些元素浓度（如 Zn、Cu、Co 和Fe）在个体之间存在较大差异，同时也发现Ca 和P 从核心区到内壳边缘含量有所下降，但P/Ca 比值始终保持一致。这项研究表明章鱼内壳内部和更多的钙化部分适用于微量元素分析。Chung 等[95]对虎斑乌贼（Sepia pharaonis）的内壳进行了微量元素分析，结果表明，温度和生长速率对乌贼内壳中的Li/Ca和Sr/Ca元素比值均有影响，并且生长速率对其比值变化的影响最大。同时作者结合以往研究认为，乌贼内壳中Sr/Ca 受生理影响的机制尚不清楚，因此不宜作为乌贼生长的替代品。而Li/Ca 的比值可能是乌贼生长的一个潜在指标，可以用于研究乌贼的生长和生态。Doubleday 等[96]采用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪（LA-ICP-MS）对毛利蛸（Octopus maorum）内壳中的12 种元素进行了分析，研究了塔斯曼尼亚东南部章鱼的种群结构和扩散规律。目前，国内外学者对于内壳微量元素的研究主要应用于生长、种群结构、医药学等，尚未见到应用于洄游中的报道。

2.4.2稳定同位素 目前，对于内壳的稳定同位素研究主要集中在δ13C、δ15N 和δ18O 上。Ruiz-Cooley等[97]通过对内壳δ13C 和δ15N 的分析，探讨茎柔鱼（D.gigas）的摄食变化。通过对茎柔鱼摄食变化的分析，推测出茎柔鱼在生活史中没有进行大范围移动，而是在较小的纬度范围内移动。Lorrain 等[98]通过对内壳δ13C 和δ15N 的分析，对秘鲁外海所采集的茎柔鱼（D.gigas）进行研究，发现个体间食性并不是随着个体大小的变化而转变，同时，通过对内壳生长纹连续切割后的δ13C 测定发现，在其生活史过程中，会出现一个或多个洄游现象。贡艺等[99]通过对内壳进行连续切割，测定连续切割片段的碳、氮稳定同位素比值，分析茎柔鱼（D.gigas）的生长发育过程中的食性转换和栖息洄游。结果表明随个体生长发育，茎柔鱼洄游有从高纬度到低纬度的趋势。

此外，Bettencourt 等[100]认为乌贼（Sepia officinalis）内壳中的氧同位素可以揭示生活环境的温度史，其通过对乌贼内壳中的氧稳定同位素测定发现，不同栖息地的水温差异导致了乌贼内壳的δ18O 的不同。Dance 等[101]对地中海3 种乌贼（雅乌贼Sepia elegans、乌贼S.officinalis、粉红乌贼Sepia orbignyana）内壳的核心和边缘的δ13C 和δ18O 进行测定，发现乌贼（S.officinalis）内壳中的同位素低于雅乌贼（S.elegans）和粉红乌贼（S.orbignyana），且乌贼边缘δ13C 和δ18O 的值高于核心区域的值，其认为这种差异可能是由于乌贼从近岸向近海越冬洄游造成的。总的来说，乌贼内壳中的δ13C 和δ18O 可以帮助我们了解幼年和成年栖息地之间的洄游模式。

3 总结与展望

近年来，随着微化学技术不断进步与创新，基于生物体硬组织微量元素与稳定同位素，成为推测头足类洄游分布的主要方法之一（表1）。

表1 硬组织微化学技术在头足类洄游中的应用Table 1 Application of microchemistry technology of hard tissues in migration of Cephalopod

3.1 耳石

目前，国内外学者在耳石微化学研究中取得一定进展，但仍然存在着一些问题。首先，迄今为止，对头足类耳石有机成分的分析只能得到整体水平的信息，缺乏时间分辨率。因此，许多研究人员对耳石的主要成分碳酸钙进行广泛研究，集中于耳石结晶碳酸钙中的微化学的年代学，以推断头足类的生活史[10]。然而，至今还没有研究能阐明蛋白质有机基质中的微化学年代学，相反，耳石整体已有较多研究，用以推断蛋白质化学特征[102]。这种方法消除了时间推断的可能性，并且依赖于严格的去钙技术，这可能会改变蛋白质组成[103]；其次，对于耳石元素研究主要集中在Sr、Ca、Na、Ba、C 和O等少数元素上，而涉及其它元素的研究较少，需要有效探索其它元素与各环境因素间的关系；第三，耳石稳定同位素的研究主要集中在鱼类，而对于头足类洄游的研究较少；第四，耳石中化学元素沉积的机制还不完全清楚，化学元素变动规律研究得也比较少[65]，今后需要加强这方面的研究。

3.2 角质颚

与耳石相比，角质颚更易获取，且形态体积较大，容易切割。目前，对于角质颚微量元素的研究主要是微量元素（Na、P、Zn）与环境因子（SST）相结合进行分析，推测个体的洄游路线。在今后研究中，要考虑到其它微量元素，结合更多环境因子（如盐度、叶绿素浓度等）进行分析，推测个体的洄游路线。角质颚中的蛋白质和丁几质生长是不可逆的，能够永久记录个体生活史中各阶段的信息[91]。通过对角质颚不同时间序列截面的稳定同位素（δ13C、δ15N）进行分析，可以得到摄食生态和营养级变化，从而推测其洄游路径。然而，在研究那些迁移范围较广的捕食者的摄食生态时，由于其胃中未消化的角质颚来源于不同的水域环境，导致通过角质颚的稳定同位素来确定捕食者的摄食生态会存在一定的误差[104]。尽管如此，角质颚稳定同位素对于头足类的摄食生态、栖息地重建和洄游路线推测等方面的研究仍具有良好的前景。

3.3 眼睛

微量元素分析通常应用于钙化的结构上[105]，而眼睛晶体的钙化程度基本为零[23]，因此并不适合用于微量元素分析。但眼睛晶体中含有大量蛋白质，适用于碳氮稳定同位素分析。与耳石相比，眼睛晶体为δ15N 分析提供丰富的氮物质，且晶体同位素数据的时间分辨率具有季节性，甚至更好[84]。目前，对于眼睛晶体的研究也存在一些缺点，主要是眼睛晶体中的部分结构容易老化，在取样过程中容易破坏晶体中的结构，以及晶体生长纹的不确定性，导致年龄的测定存在限制。在今后研究中，应注意眼睛的提取与保存，并结合耳石年龄数据，掌握眼睛晶体各层形成的时间，从而重建个体生活史信息。

3.4 内壳

头足类内壳中含有钙物质，适用于微量元素分析。目前，对于内壳微量元素的研究主要应用于生长、种群结构、医药学等，尚未见到应用于洄游中的报道。而内壳稳定同位素分析在头足类洄游中取得了一定进展。除碳氮稳定同位素外，氧的稳定同位素在乌贼内壳中应用更为广泛，在今后研究中，应该要注重对氧同位素的研究。

综上所述，硬组织的微化学在头足类的洄游分布研究中已取得了一定进展。但目前对于洄游路径的研究大多数仍处在推测等定性分析上。在对硬组织测定分析时，往往只选取一个截面进行测定，而忽视了其它截面。另外，每个硬组织都有其优缺点（表2），在大多数研究中，往往只使用单一的硬组织进行分析，这样会导致一些信息存在着较大误差，从而使结果出现偏差。在未来研究中，应注重微量元素与稳定同位素的结合或硬组织之间的结合，来进行头足类的洄游路线的分析，以提高预测的准确性和可靠性。

表2 头足类各硬组织的优缺点Table 2 Advantages and disadvantages of Cephalopod hard tissues