达原饮胃漂浮片的提取工艺研究

申 茹，徐英辉，郭玉岩，麦艳珍，余 巧，毛一中

（1.惠州卫生职业技术学院 药学系，广东 惠州 516025；2.惠州市药用植物研究与开发重点实验室，广东 惠州516025；3.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨150040）

达原饮出自明代医家吴又可所著《温疫论》，是开达膜原的代表方，方中槟榔辛散湿邪，草果辛香化浊，厚朴芳香化浊，白芍、知母清热滋阴，黄芩清热燥湿，甘草调和诸药[1]，传统医学采用达原饮能辛散、燥湿、化浊，直达膜原，主治瘟疫或疟疾邪伏膜原之证[2]。现代医学研究发现达原饮被应用于新型冠状病毒肺炎的治疗。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》和全国24个省市自治区卫生管理部门发布的地方方案中有9个明确提出了达原饮的应用[3]，尤其是对早期新型冠状病毒肺炎起到较好作用。新型冠状病毒中医学称为戾气、疠气、疫疠之气等[3]。新冠肺炎患者早期多有身热不扬、干咳痰少、倦怠乏力、口干不欲饮，伴纳差、便溏、恶心欲呕等消化道症状，舌质多暗或边尖稍红，舌苔厚腻。国家中医专家组根据采集的四诊信息，辨证研判新冠肺炎[4-5]属于“湿毒疫”，早期为湿毒郁肺，进而出现疫邪困脾闭肺、化热的一系列邪伏膜原相关临床表现，提出从宣肺透邪、化湿解毒来论治，推荐处方之一是开达膜原的代表方达原饮。为了更好的发挥达原饮的疗效，拟将其开发成现代中药新剂型胃内漂浮片，提高生物利用度的同时，也便于携带和使用，提高患者顺应性。

达原饮原方采取水煎煮法，但未建立多指标成分的含量控制方法，为了使该处方药材中活性成分最大获得量，本实验采用回流提取法以芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芒果苷和新芒果苷为检测指标对提取工艺进行考察，为后期制剂工艺的研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2040C型3D Plus高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DTY-124/223型电子天平［万分之一，华志（福建）电子科技有限公司］；PS-40A型超声波清洁机（深圳市科洁超声科技有限公司）； HH-8型数显恒温水浴锅（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；Eppendorf移液器（德国艾本德公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；超纯水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；磷酸（分析纯，台山市粤侨试剂塑料有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

芍药苷对照品（批号：191208）、新芒果苷对照品（批号：200618）、芒果苷对照品（批号：200116）、黄芩苷对照品（批号：200117）、汉黄芩苷对照品（批号：200719）、黄芩素对照品（批号：191206）均购自北京世纪奥科生物技术有限公司，纯度大于98%。

白芍、黄芩、知母、厚朴、甘草、草果、槟榔均购于北京同仁堂惠州药店有限责任公司，经惠州卫生职业技术学院中药教研室祁银德教授鉴定为正品，具体药材信息见表1。

表1 药材信息表Tab. 1 Information table of medicinal materials

2 方法与结果

2.1 芍药苷等6种有效成分含量测定

2.1.1色谱条件 色谱柱：Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 mm × 50 mm，2 μm）（日本岛津公司）；检测波长：芍药苷230 nm，黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素280 nm，芒果苷、新芒果苷258 nm；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min；进样量：0.5 μL，流动相为0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱条 件（0～5 min，12.5%～19% B；5～7 min，19%～24%B；7～9 min，24%～27%B；9～12 min，27%～32% B；12～14 min，32%～50%B；14～16 min，50%～70%B）。

2.1.2对照品溶液的制备 精密称定6种有效成分对照品适量，加入85%乙醇制成含芍药苷85.93 µg/mL、黄 芩 苷372.88 µg/mL、汉 黄 芩 苷91.53 µg/mL、 黄 芩 素11.69 µg/mL、 芒 果 苷22.88 µg/mL、新芒果苷115.93 µg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 称取达原饮处方量（白芍 3 g、黄芩 3 g、知母 3 g、厚朴 3 g、甘草 1.5 g、炒草果仁 1.5 g、槟榔 6 g）药材粉末（过2号筛），加入20倍量85%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并滤液，定容，摇匀，即得。

2.1.4系统适用性试验 取对照品、供试品、阴性对照溶液，按“2.1.1”项色谱条件下进样，结果见图1。由图可知，供试品和对照品均能得到较好的分离，阴性对照溶液在相应保留时间无干扰。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.5线性关系考察 精密称取6种有效成分对照品适量，用85%乙醇配制成对照品溶液，依次稀释成6个不同浓度，分别进样0.5 μL，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样浓度（X）为横坐标，进行线性回归，结果见表2。

表2 回归方程、相关系数和线性范围Tab. 2 Regression equation，correlation coefficient and linear range

2.1.6方法学考察 6种有效成分精密度、重复性、稳定性试验RSD均小于3%，符合相关要求。加样回收率试验结果显示芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芒果苷、新芒果苷平均加样回收率分别为102.8%、101.9%、98.5%、99.2%、99.3%、99.7%，RSD均小于3%。

2.2 达原饮胃漂浮片提取工艺研究

2.2.1计算综合得分 综合得分：W=A× 0.2 +B×0.3 +C× 0.15 +D× 0.05 +E× 0.15 +F× 0.15[6]

A：芍药苷含量；B：黄芩苷含量；C：汉黄芩苷含量；D：黄芩素含量；E：芒果苷含量；F：新芒果苷含量。

2.2.2提取方法考察 称取达原饮处方药材粉末6份，各加入20倍量85%乙醇，分别采用回流法1 h、超声法1 h、冷浸法24 h、滤过，定容，按“2.1.1”项下色谱条件检测6种有效成分含量，计算综合得分，结果见图2。

图2 提取方法考察Fig.2 Extraction method study

由图2可知，采用回流法1 h综合得分最高，故选择回流法为最佳提取方法。

2.2.3单因素考察 （1）溶剂浓度的筛选 称取达原饮胃漂浮片处方量药材，固定液料比为20∶1（mL/g），提取1 h，分别采用75%、85%、95%乙醇为提取溶剂，提取1次进行试验，按“2.1.1”项下方法测定含量并计算综合得分，结果见表3。

表3 溶剂浓度考察结果Tab. 3 Single factor results of solvent concentration

（2）提取时间的筛选 称取达原饮胃漂浮片处方量药材，固定液料比为20∶1（mL/g），85%乙醇，分别提取0.5、1、1.5 h，提取1次进行试验，按“2.1.1”项下方法测定含量并计算综合得分，结果见表4。

表4 提取时间考察结果Tab. 4 Single factor results of extraction time

（3）提取次数的筛选 称取达原饮胃漂浮片处方量药材，固定液料比为20∶1 （mL/g），85%乙醇，提取1 h，分别提取1次、2次、3次进行试验，按“2.1.1”项下方法测定含量并计算综合得分，结果见表5。

表5 提取次数考察结果Tab. 5 Single factor results of extraction times

（4）料液比的筛选 称取达原饮胃漂浮片处方量药材，85%乙醇，提取1 h，分别选择15∶1、18∶1、20∶1 （mL/g），提取1次进行试验，按“2.1.1”项下测定含量并计算综合得分，结果见表6。

表6 料液比单因素考察结果Tab. 6 Single factor results of solid-liquid ratio

2.2.4正交试验

在单因素考察基础上，选择溶剂浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察对象，采用L9（34）正交试验对达原饮胃漂浮片药材提取工艺进行考察，筛选出最佳提取工艺，试验结果见表7 ～ 9。

表7 因素与水平表Tab. 7 Factor and level table

由表8直观分析结果可知，回流提取法中各因素对6种有效成分含量综合得分影响的大小顺序是溶剂浓度>提取时间>料液比>提取次数。达原饮胃漂浮片药材最佳提取工艺为A2B3C2D2，即85%乙醇，料液比为20∶1，提取时间为1 h，提取2次。由表9方差分析结果表明，因素A具有显著性差异，P<0.05，其它因素不显著。因此，确定达原饮胃漂浮片药材提取最佳工艺：取达原饮7味处方量药材，加入20倍量的85%乙醇回流提取2次，每次1 h。

表8 正交试验设计及结果Tab. 8 Orthogonal experimental design and results

表9 正交试验方差分析表Tab. 9 Variance analysis of orthogonal experimental design

2.2.5验证试验 将达原饮胃漂浮片处方量药材放大10倍，按正交试验优化出的最佳提取工艺进行3次验证试验，结果见表10。

表10 验证试验结果Tab. 10 Verification testing results

由表10可知，三批工艺验证试验芍药苷含量均值为2.94%，黄芩苷含量均值为12.84%，汉黄芩苷含量均值为2.92%，黄芩素含量均值为0.15%，芒果苷含量均值为2.58%，新芒果苷含量均值为1.72%，RSD值均小于1%，证明达原饮胃漂浮片药材提取工艺稳定可行。

3 讨论

达原饮由槟榔、草果、厚朴、白芍、黄芩、知母和甘草七味药组成。槟榔为君药，主要活性成分为槟榔碱，槟榔碱在高温下容易分解，采用回流提取法会导致槟榔碱含量减少，且槟榔碱是小分子生物碱，在C18柱上几乎无保留，难以成为稳定的质控指标[7-9]。参照《中国药典》及文献报道，白芍有效成分为芍药苷[10-11]；黄芩中主要活性成分为黄酮类化学成分，其中黄芩苷、汉黄芩苷及黄芩素活性明显[12-13]；知母的有效成分为芒果苷和新芒果苷[14-15]。以多指标成分评价可有效控制达原饮的质量，据此，本实验以芍药苷等6种活性成分为指标优化达原饮胃漂浮片提取工艺。

将达原饮供试品溶液通过HPLC二极管阵列检测器进行全波长扫描，6种活性成分分别在230、280和258 nm波长下基线平稳，完全分离，且色谱峰面积最大，故选择芍药苷最大吸收波长为230 nm，黄芩苷、汉黄芩苷和黄芩素最大吸收波长为280 nm，芒果苷和新芒果苷最大吸收波长为258 nm。

采用HPLC法对6种有效成分含量进行测定，考察不同系统和比例的流动相，如甲醇-0.05%甲酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液对分离效果的影响，结果显示乙腈-0.05%磷酸分离效果最好，并对该系统不同体积比进行优选，确定梯度洗脱程序6种有效成分保留时间适当，13 min内全部分离，且峰形好，分离度和理论塔板数均符合《中国药典》要求。

4 结论

本实验以芍药苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、芒果苷和新芒果苷为指标成分，采用单因素及正交试验法对达原饮胃漂浮片药材进行提取工艺考察，确定最佳提取工艺为20倍量的85%乙醇提取2次，每次1 h，且回流提取法操作简单易行，为后期达原饮胃漂浮片的制备和质量控制提供科学依据。