假单胞菌PL-21的鉴定及其拮抗2种苹果病原菌的作用

路兆军 于晓丽 苗杰 赵莹 王淑惠 陈丽英 李保进

关键词： 假单胞菌;生物防治;苹果病原菌

中图分类号： S432.9+ 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）03-0808-04

Identification of Pseudomonas sp. PL-21 and its antagonistic effect on two apple pathogens

LU Zhao-jun1， YU Xiao-li2， MIAO Jie1， ZHAO Ying1， WANG Shu-hui1， CHEN Li-ying1， LI Bao-jin1

（1.Yantai Research Institute of Forestry，Yantai 264013，China;2.Yantai Agricultural Sci & Tech Institute of Shandong Province，Yantai 265500，China）

Key words： Pseudomonas sp.;biological control;apple pathogens

无致病假单胞菌是一类分布广泛、资源丰富的革兰氏阴性菌，目前已发现多种假单胞菌对植物的促生及防病作用明显，具备开发成为生防制剂的潜力[1-3]。其生防机制主要包括分泌噬铁素参与植物根际营养竞争、分泌抗生素类物质抑制病原菌生长、诱导植物产生系统抗病性等[4-6]。苹果斑点落叶病、苹果褐斑病分别是由苹果链格孢强毒菌株（Alternaria alternaria f.sp mali）、苹果盘二孢（Marssonina coronaria Davis）侵染引起的病害，这2种病害因显病时间长、扩散速度快、危害严重等特点逐渐成为苹果生产上的主要病害[7-9]，病害大流行時，两者与其他苹果早期落叶病极易形成复合侵染，使果树叶片在8-9月即大量脱落，影响苹果的产量和经济效益[10-11]。

目前，苹果斑点落叶病、褐斑病等苹果主要病害的防治主要依赖于化学农药，其成本低廉且见效快，但长期重复使用单一化学药剂带来的病原菌耐药性、果品农药残留，危害人体健康及环境污染等问题日益突出[12]。因此，开发应用高效生防菌剂防治此类病害具有重要意义。本研究以从烟台市蓬莱区苹果根际分离到的1株假单胞菌PL-21为对象，明确其分类地位，分析其对苹果斑点落叶病病原菌等的抑菌活性及离体防效，为今后相关病害生防制剂的开发与应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

假单胞菌PL-21分离自烟台市蓬莱区苹果根际，由烟台市林业科学研究所实验室保存。苹果斑点落叶病病原菌（Alternaria alternaria f.sp mali）、苹果褐斑病病原菌（Marssonina coronaria Davis）、苹果圆斑病病原菌（Phyllositic solitaria）、苹果轮斑病病原菌（Alternaria mali Roberts）由本实验室保存，苹果轮纹病病原菌（Botryosphaeria dothidea）、苹果炭疽病病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）由烟台市农业科学研究院提供。马铃薯胡萝卜培养基（PCDA）[13]用于病原菌的保存及拮抗菌株抑菌分析;牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）用于拮抗菌株发酵、培养;牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）用于拮抗菌株培养、保存。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株PL-21的鉴定 按照《常见细菌系统鉴定手册》[14]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[15]的方法对菌株PL-21进行形态和生理生化特征鉴定。以PL-21总DNA为模板，用细菌16 S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增并由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。测序结果与 NCBI 数据库进行BLAST序列比对，下载同源性较高的相关菌株基因碱基序列，利用 MEGA软件采用邻接法构建系统发育树。

1.2.2 菌株PL-21的抗菌活性分析 采用平板对峙法[16]测定菌株PL-21对苹果斑点落叶病病原菌等的拮抗活性，以不接种PL-21的平板作对照，28 ℃恒温培养5～8 d，3次重复。采用菌丝生长速率法[17]测定菌株PL-21无菌发酵滤液对苹果斑点落叶病病原菌等的抗菌活性：将菌株PL-21活化后按2%的体积比接入含100 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，30 ℃、200 r/min振荡培养72 h即得发酵液，发酵液经5 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm的微孔滤器过滤除菌后得到发酵滤液。发酵滤液按1∶50的体积比与50 ℃左右已灭菌的PCDA培养基混匀后倒平板，用6 mm打孔器打取活化好的指示菌菌饼置于平板中央，以未加发酵滤液的平板为对照，28 ℃恒温培养5～8 d，3次重复。抑菌率计算公式：抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100%。

1.2.3 菌株PL-21发酵滤液对指示菌孢子萌发的抑制作用 苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌在PCDA平板上培养10 d后，用无菌水冲洗菌落配制成孢子悬液，按1∶1（体积比）分别将100%、60%、20%的发酵滤液与1 ml 1×104个的2种病原菌孢子悬液混合，使发酵液终体积分数为50%、30%、10%，以NB培养液按同样比例与2种病原菌孢子悬液混合作对照，28 ℃ 培养，6 h、12 h、24 h后镜检，芽管长度超过分生孢子小端直径50%视为萌发，3次重复，计算孢子萌发抑制率[18]。

1.2.4 菌株PL-21发酵滤液对指示菌的离体防效 采用平皿叶片法[19]进行菌株PL-21的离体防效试验。清洗干净健康苹果新叶后用75%酒精浸泡10 s，无菌水冲洗并置于超净台晾干，在PL-21发酵滤液中浸渍1 h，超净台内晾干，以在NB培养液中浸渍1 h为对照。处理结束24 h后用手术刀擦伤苹果新叶，配制含量为1 ml 1×106个的苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌孢子悬液，每个叶片上滴60 μl孢子悬液并涂抹均匀后保湿培养，每个处理20张叶片，3次重复。10 d后按照病情分级标准进行调查和统计防效[20]。病情指数和防治效果公式如下：病情指数（%）=Σ（本级代表值×本级叶数）/（最高发病级代表值×调查总叶数）×100%;防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.2.5 数据处理 利用 SPSS 22.0 软件进行数据的统计分析，采用Duncans新复极差法进行多重比较及显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 菌株PL-21的形态特征

菌株PL-21在NA平板上生长24 h后，形成近圆形、乳白色至淡黄色菌落，边缘较为规则，中央稍隆起，不透明，菌体杆状，革兰氏阴性。

2.2 菌株PL-21的生理生化特征

菌株PL-21的生理生化试验结果表明，该菌为好氧菌，硝酸盐还原试验无颜色变化，可液化明胶试管培养基，葡萄糖发酵反应无气泡产生及颜色变化，淀粉水解反应不产生水解圈，在加入 2% 氯化钠的平板上可正常生长但不能在加入 5%氯化钠的平板上生长，在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上于4 ℃条件下可缓慢生长。参考《常见细菌系统鉴定手册》，菌株 PL-21与假单胞菌的特征基本相似。

2.3 菌株PL-21的16 S rDNA序列分析

PCR 扩增16 S rDNA碱基序列及测序结果表明，菌株PL-21的16 S rDNA碱基序列长度为1 435 bp，将该序列提交到GenBank数据库，获得登录号GenBank NO. MT378354。将该序列与 GenBank 数据库收录的代表菌株的 16 S rDNA碱基序列进行BLAST比对，结果与假单胞菌属的几个种的碱基序列相似度达99%以上。用MEGA5构建系统发育树，结果发现菌株PL-21与假单胞菌AAS-156（KY810664.1）聚类在一个分支上。结合形态观察、生理生化測定及系统发育分析结果，初步确定菌株PL-21为假单胞菌 （Pseudomonas sp.）。

2.4 假单胞菌PL-21及其发酵滤液的抗菌活性

经平板对峙法分析假单胞菌PL-21的抗菌活性，结果表明，PL-21对6种病原菌具有不同程度的拮抗活性，其中对苹果斑点落叶病病原菌、苹果圆斑病病原菌、苹果轮斑病病原菌的抑菌带宽度分别为2.70 cm、1.72 cm、1.23 cm，对苹果褐斑病病原菌、苹果轮纹病病原菌、苹果炭疽病病原菌的抑菌带宽度分别为0.87 cm、0.95 cm、0.33 cm。

多数生防菌在发酵时可产生多种次生代谢产物来抑制植物病原菌的生长。菌丝生长速率测定结果表明，假单胞菌PL-21的发酵滤液对苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌的抑制率较高，分别为59.4%、65.22%，对苹果轮纹病病原菌、苹果圆斑病病原菌、苹果轮斑病病原菌的抑制率次之，对苹果炭疽病病原菌的抑制率最低，仅为7.46%。

2.5 PL-21发酵滤液对指示菌孢子萌发的抑制作用

终体积分数为50%、30%、10%的PL-21发酵滤液均可抑制指示菌孢子萌发，相同的时间内抑制率随体积分数增大而升高，同体积分数抑制率随时间延长而降低，终体积分数为50%的发酵滤液24 h时对苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌孢子萌发的抑制率分别为60.6%、71.7%。

2.6 PL-21发酵滤液对指示菌的离体防效

经PL-21发酵滤液处理后，叶片上苹果斑点落叶病病斑、苹果褐斑病病斑呈褐色、边缘清晰且面积明显小于对照，叶片仍然呈绿色;对照组叶片病斑逐渐变大后呈褐色或黑褐色且连成片状，根据病情分级标准对防效试验的定量统计结果显示，处理组病情指数明显降低，分别比对照降低40.37%、50.37%，PL-21发酵滤液可显著降低苹果叶片的发病程度，离体防效分别为54.50%、63.55%（表1）。

3 讨论

本研究通过形态观察、生理生化指标测定及16 S rDNA碱基序列分析，初步判定从苹果根际中分离的PL-21为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。假单胞菌作为拮抗微生物已被应用于多种植物病害的生物防治[21]，如娄海博等[22]分离的荧光假单胞菌SN15-2对番茄青枯病的防效可达46.58%，董国菊等[23]发现荧光假单胞菌P-72-10可显著抑制烟草疫霉菌菌丝生长，且对烟草黑胫病也有良好的控病效果。本研究首次明确了假单胞菌PL-21对6种苹果病原菌的广谱拮抗活性，进一步拓宽了假单胞菌的生防应用范围;其发酵滤液对苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌菌丝抑制率分别高达59.40%、65.22%，结合唐远江[24]、宁爽[25]的研究结果分析，可能是PL-21分泌的抗生素、纤维素酶等代谢产物对病原菌生长具有毒力效应，随后的孢子萌发试验验证了这一推测：PL-21发酵滤液对苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌孢子萌发的抑制作用随发酵滤液体积分数升高而升高，50%发酵滤液在24 h对2种病原菌孢子萌发的抑制率分别为60.6%、71.7%。由于生防菌株在实际应用中需要克服植物表面诸如湿度、营养、微生物等多种因素才能发挥效能[20]，本研究测定了PL-21发酵滤液对苹果斑点落叶病、苹果褐斑病的离体叶片防效，结果分别为54.50%、63.55%，这与拮抗试验结果和孢子萌发试验结果具有一致性，进一步验证了PL-21的生防潜力。

PL-21及其发酵滤液对苹果常见病害的广谱抑菌特性，特别是对苹果斑点落叶病病原菌、苹果褐斑病病原菌的高拮抗活性和较好的离体防效，丰富了相关病害生物防治的微生物资源及技术储备。在后续试验中，一方面需结合抗菌物质合成基因分析、蛋白质质谱分析等手段明确PL-21的抗菌代谢产物类型，另一方面，由于假单胞菌作为一类常见的植物根际促生菌，对植物具有明显的促生作用[26-28]，还需验证PL-21的果园防效及其对苹果的促生效果，为相关生防制剂的开发利用奠定基础。

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（责任编辑：陈海霞）