对Deinococcus actinosclerus RM菌株分泌蛋白的预测

柯 野，彭阳选，李昊然，刘曜荣，梅颖诗，郭 阳

（韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）

随着国家政策对畜牧养殖业扶持与推广，使得我国畜牧养殖业飞速发展，我国家禽生产量已跃居全球第2位，据估算，此行业每年产生的干羽毛量约130万t［1］.羽毛中的粗蛋白含量高达80%，氨基酸含量则达到70%，由此可见，羽毛具有十分可观的开发利用价值［2］.羽毛的主要成分是角蛋白，角蛋白亦被称为硬性角蛋白，不容易被一般的蛋白酶所降解.然而，废弃的羽毛不仅对环境有极大的危害作用，而且羽毛中的蛋白质资源也不能得到充分有效的利用［3］.因此，越来越多的研究者关注于对羽毛的有效降解.一方面，以期实现羽毛中蛋白质的高值化利用.另一方面，则希望通过经济环保的方式，解决废弃羽毛对生态环境带来的危害.据报道，在自然界中已离获得具有降解废弃羽毛的微生物30多种，并且在细菌、放线菌和真菌［4-6］中均有分布，如细菌中的枯草芽孢杆菌属和放线菌中链霉菌属，它们主要产生碱性蛋白酶，可应用于高蛋白动物饲料、原料皮的脱毛和植物含氮肥料添加剂等领域的开发［7］.

本文前期研究中已分离筛选获得一株Dactinosclerus actinosclerusRM（下文简称RM菌株）野生型菌株，它是一株具有高效降解羽毛的细菌菌株（初测对4.0%的羽毛粉有高达64.0%的降解率）.目前未见对该菌株所属的属和种的分泌蛋白系统研究.因此，本文采用生物信息学知识和在线网站对RM菌株全基因组序列编码的分泌蛋白进行预测和分析，以此可知该菌株对羽毛高效降解作用的相关酶，进一步对该酶的基因、结构与功能进行深入的研究，更全面地为探究RM菌株降解羽毛的机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源

RM菌株是本实验室分离筛选获得的一株具有高效降解羽毛的优势菌株，由本实验室保藏提供.

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，氯化钠5.0 g，蛋白胨10.0 g，水1 000 mL，pH自然.

1.1.3 试剂

牛肉膏、蛋白胨、琼脂糖等试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，化学试剂均为国产分析纯试剂.

1.2 试验方法

1.2.1 RM菌株的培养

将RM菌株接种在牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180 rpm震荡培养4 d后，12 000 rpm离心3 min，收集菌体备用.

1.2.2 RM菌株基因组DNA的提取

按照酵母DNA快速提取法［8］，提取RM菌株的基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，对其质量进行分析.

1.2.3 RM菌株的基因组测序

将电泳鉴定合格的RM菌株基因组DNA，送至生工生物工程（上海）股份有限公司的广州测序部进行全基因组测序.采用Illumina Hiseq 2500平台对RM菌株基因组进行高通量测序，采用高通量序列数据的质量控制工具FastQC（软件版本 0.11.2）对测序的原始数据质量可视化评估；为获得相对准确的有效数据，再利用Trimmomatic（软件版本0.36）数据过滤工具对数据进行质量剪切；通过基因组测序数据的拼接软件SPAdes（软件版本3.5.0）对测序数据进行拼装，之后采用Kmer值进行组装，最终根据各Kmer值组装获得最佳的序列结果.将获得的RM菌株基因组序列提交至GenBank数据库，根据NCBI网站提供的Prokaryotic Genome Annotation Pipeline注释系统对基因功能进行预测和注释，同时也利用NCBI Blast+将基因蛋白序列与KEGG、COG、Swissprot和NR等多个数据库进行比对，进一步确定注释基因的结构与功能.

1.2.4 RM菌株分泌蛋白的确定方法

运用Bio-Edit 7.0软件对基因和蛋白质的序列组成、比对等进行分析；蛋白质编码序列的N端信号肽预测分析、筛选，通过在线程序：SignalP-4.1完成；蛋白质的亚细胞定位预测分析通过网站：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php完成.蛋白质的跨膜结构域预测分析通过网站：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/完成.

2 结果与分析

2.1 RM菌株的基因组测序结果

通过SPAdes对二代测序数据进行拼装后，获得RM菌株测序全长为4 013 522 bp，最长测序片段长度为79 609 bp，平均长度为12 088.92 bp，N50的长度为21 827 bp，GC含量为0.70，连续交叠群共有332个.将RM菌株基因组序列提交至GenBank数据库，获得登录号为QYCQ00000000.1.根据GenBank数据库的基因注释系统分析，RM菌株基因组全长为341 632 bp，共计有3 869个蛋白质编码基因，再将每个CDS编码的氨基酸序列与KEGG、COG、Swissprot和NR等数据进行比对，其中有3 820个基因序列能被同源基因注释分类.

2.2 RM菌株蛋白质的信号肽预测结果

对RM菌株全基因组预测编码的3 869条蛋白进行信号肽预测，结果表明：所有的编码蛋白质中仅439条蛋白具备典型信号肽序列，占比11.35%.而3 430条蛋白均为胞内蛋白，占比88.65%.这表明RM菌株的分泌蛋白占少数，大多数为胞内蛋白.

2.3 含有信号肽的蛋白质的氨基酸残基情况分析

439条具有信号肽的蛋白质中，氨基酸残基总数为144 145个，各种氨基酸的含量如图1.由图1可知，在20种氨基酸中，数量多的分别是丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸和缬氨酸，摩尔比分别为13.25%、9.95%、9.50%、9.19%和7.83%，总计达到49.72%.这些氨基酸残基都具有侧链基团简单、不含环状结构、分子量相对较小、占据空间结构少等特点.其含量较高的原因，可能是由于占据空间结构小，柔性相对较大，利于蛋白局部的构象改变，便于形成成熟蛋白质的构象.

图1 20种氨基酸在RM菌株信号肽蛋白中所含数量情况

含量较少的酪氨酸、色氨酸和组氨酸残基，摩尔比分别为2.77%、1.28%和1.01%，总计5.06%.酪氨酸、色氨酸和组氨酸侧链基团具有环状结构，含有较大的疏水性侧链基团，刚性较强、占据空间大，对蛋白质局部构象的柔性贡献小，这可能是含量较少的原因之一.

半胱氨酸是构成蛋白质的一种特殊氨基酸，能形成稳定的二硫键，对蛋白质结构局部构象的稳定性和刚性具有重要作用，由图1和图2可知，RM菌株产生的含信号肽的蛋白质中，不含或只含有1个半胱氨酸的蛋白共有196个，所占比例高达44.65%，即约一半含信号肽的蛋白不能形成二硫键.但也有6个蛋白质中含有10个以上的半胱氨酸，这些蛋白质可能形成多个二硫键.

图2 含有信号肽的蛋白质中的半胱氨酸数量

2.4 对含有信号肽的蛋白质的跨膜结构域和亚细胞定位分析

对439条含有信号肽的蛋白进行跨膜结构域及亚细胞定位预测可知，有321个胞外分泌蛋白质，34个亚细胞定位不明确的蛋白质，84个分泌型膜蛋白，在这些分泌性膜蛋白中65个蛋白有1个跨膜结构域，有7个蛋白有2个跨膜结构域，有3个蛋白具有3个跨膜结构域，有2个蛋白有4个跨膜结构域，有1个蛋白有5个跨膜结构域，有2个蛋白有9个跨膜结构域，有4个蛋白有12个跨膜结构域.结果表明含有信号肽的蛋白大多数为胞外分泌蛋白，占总数的摩尔比73.12%.

2.5 分泌蛋白的信号肽氨基酸残基分析

2.5.1 分泌蛋白的信号肽氨基酸残基组成

所有分泌蛋白质的信号肽共有氨基酸残基7 472个，平均每条信号肽含23个残基，最长的信号肽有38个氨基酸残基，而最短信号肽序列只含10个氨基酸残基.信号肽的氨基酸残基组成见图3.由图3可知：含量较高的氨基酸残基为亮氨酸和丙氨酸，占摩尔比分别为21.39%和21.08%，因为信号肽主要为线性结构，这两种氨基酸残基的侧链基团简单，可能更利于线性的信号肽形成.

图3 分泌蛋白的信号肽序列中20种氨基酸数量的分布情况

信号肽序列中疏水性氨基酸残基（如亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）占摩尔比为63.65%；带正电荷的残基（如赖氨酸、精氨酸和组氨酸）占摩尔比为9.15%；带负电荷的残基（如天冬氨酸和谷氨酸）共有86个，所占摩尔比分数为1.15%.由此可见，RM菌株的信号肽残基组成情况符合信号肽构成的一般规律，疏水性氨基酸残基为主，构成主要的疏水核心区，而少量的正电荷残基和负电荷残基组成信号肽的N端和C端［9-11］.

2.5.2 分泌蛋白的信号肽切割位点分析

对分泌蛋白信号肽末端4个氨基酸残基进行分析，结果见图4.以“1”为切割位点，依次向信号肽序列的N端排序，在4位点上数量最多的氨基酸残基是丙氨酸，共62个.在3点上含量最多的是丙氨酸，共212个.在2位点含量最多的氨基酸残基是谷氨酰胺，共52个.在1位点上含量最多的氨基酸是丙氨酸，共266个.由此推出RM菌株的信号肽切割位点序列主要属于X-A-X-A型，为SPI型信号肽识别位点.

图4 分泌型蛋白的信号肽切割位点分析

2.6 胞外分泌蛋白酶的信号肽序列分析

RM菌株对羽毛的降解主要是由于分泌蛋白酶对羽毛的降解作用，在胞外分泌型蛋白中，共10个蛋白酶（6种类型），1个M36金属肽酶类，1个C39肽酶类，1个木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶类，1个胰蛋白酶类，3个MepM肽链内切酶，3个枯草杆菌蛋白酶.6类蛋白酶信号肽序列的氨基酸残基数如图5.由图5可知，6类蛋白酶的信号肽中的各种氨基酸残基的含量基本一致，如丙氨酸和亮氨酸的含量最高，天冬氨酸和色氨酸含量最低；并且其信号肽切割位点也属于X-A-X-A型.这表明RM菌株的蛋白酶中各种氨基酸含量不因蛋白酶的种类而具有差异.

图5 6类蛋白酶信号肽中各氨基酸残基的含量情况

3 结论

本文对具有降解羽毛的优势菌株RM菌株进行了全基因组的测序，通过对该基因组编码的蛋白分析其信号肽和跨膜结构域等相关信息，得知该菌株共有439个蛋白具有信号肽序列，321个为胞外分泌蛋白，34个亚细胞定位不明确的蛋白，84个为膜蛋白.RM菌株分泌蛋白的信号肽切割位点的氨基酸残基主要序列为于X-A-X-A型，并且以疏水性的氨基酸残基为主，不同类型分泌蛋白酶的信号肽之间的序列差异较小.因此，通过本文的研究，了解了RM菌株分泌蛋白的情况，信号肽的氨基酸残基组成规律，这为对RM野生型菌株的改造，人工合成能在RM菌株中分泌表达蛋白的信号肽构建奠定了一定的基础，同时为进一步分析RM菌株对羽毛高效降解的分泌蛋白（如角蛋白酶、脂肪酶、二硫键还原酶等）的确定、功能作用奠定了基础.