自噬途径在纳米材料毒性作用中的研究进展*

许蓬娟，于志超，褚晓倩，高静，谭俊珍△

(1.天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617；2.天津中德应用技术大学科研处，天津 300350)

1 引 言

纳米材料是指其结构成分至少在一个维度上小于100 nm的材料[1]，因其独特的物理化学特性被广泛应用。尽管纳米材料有其优越性，但其对人体的毒性及与决定细胞命运的细胞机制的相互作用的认识仍极其有限。在此，我们对纳米材料毒性与自噬的机制的关系及其潜在意义进行归纳总结，旨在增加对纳米材料与自噬机制的相互作用的理解。

2 纳米材料的毒性作用

目前，商用纳米材料越来越普遍，人们可以通过各种消费品接触到纳米材料。同时，纳米医学的快速发展将纳米材料广泛应用于临床诊断和治疗，大量纳米药物被设计用于治疗各种疾病，如神经系统疾病、糖尿病、癌症、传染病和过敏等[2]。这使人体完全暴露在纳米材料的环境中，因此，纳米材料的生物安全性问题引起越来越多的关注[3-4]。

纳米材料一旦被人体吸收，可分布在心脏、脑实质、肝脏、骨髓等多个器官[5-6]，由于其独特的尺寸及高表面积，尤其是表面修饰后，纳米材料还可以越过多个人体生物屏障，如血-脑屏障、血-睾屏障[7-8]。研究表明，多种纳米材料对人类健康存在潜在危害。

在大鼠及小鼠模型中均证实吸入或滴注纳米碳黑或其他碳纳米材料，可以造成过敏或肺部炎症反应[9-11]，并会诱发大鼠肺部肿瘤[12]。Belyanskaya等[13]发现单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)对鸡胚有明显的神经毒性作用，可以显著减少神经胶质细胞的数目，且使细胞电生理功能降低。此外，SWNTs还可以抑制胚胎发育，甚至导致胚胎死亡[14]。Lara-Martínez等[15]则发现功能化多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes, MWNTs)对鸡胚也具有严重的毒性作用。

典型的金属纳米材料，如纳米银(Ag)、纳米金(Au)、纳米铜(Cu)以及各类纳米氧化物等，也均被证实对细胞或机体有毒性作用。纳米Ag对MCF-7细胞有毒性作用，低浓度纳米Ag可诱导细胞发生坏死和凋亡，而高浓度纳米Ag则会引发细胞坏死[16-17]。此外，纳米Ag还可以造成人类皮肤、纤维肉瘤和睾丸癌细胞等不同实验模型的细胞死亡[18-20]。纳米氧化锌(ZnO)对酵母、海鱼胚胎及其发育均有较强的毒性作用[21-22]。纳米ZnO和纳米二氧化钛(TiO2)等在各种动物模型中均被发现可在大脑沉积，并产生神经毒性[23-24]。纳米TiO2对人体及环境健康都有较强的毒性作用。此外，纳米Cu及纳米氧化铜(CuO)对细胞及大鼠均有急性毒性效应，会造成细胞死亡及动物存活率降低等，且肝脏和肾脏是其影响最大的器官，也是其他多种纳米材料毒性作用的靶器官[25-28]。

目前，美国环境保护署报告将人工纳米粒子归为具有未知毒性物质[29]。鉴于纳米材料的广泛应用及其对人体、环境潜在的危害，为保证纳米科技的健康发展，对纳米技术的生物安全评估十分重要，而寻求纳米材料普遍的毒性机制成为当前的研究热点。

3 自噬途径

自噬(Autophagy)是真核细胞中的固有信号活动，可消除损伤、老化蛋白或细胞器，对维持细胞体内平衡过程发挥重要作用。正常的生理状态下，自噬扮演细胞保卫者的角色用以抵抗意外死亡。自噬的保护作用有助于急性期细胞存活反应，而长期自噬会产生慢性损伤[30]。自噬有两种基本类型，即选择性和非选择性自噬，选择性自噬又可以根据如何转运物质及其机制进行进一步分类，如大自噬、小自噬及分子伴侣介导的自噬。其中，大自噬是最典型的、最主要的自噬途径。自噬一般分为四个阶段：启动阶段、延伸阶段、成熟阶段和降解阶段。首先，泛素蛋白复合物或其它细胞垃圾可以刺激自噬途径启动。其中，Beclin-1是自噬起始阶段一种关键蛋白质，Beclin-1首先与磷脂酰肌醇3-激酶(the class III phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)和自噬相关(autophagy-related, Atg)蛋白14结合进而招募其他相关蛋白，因此，Beclin-1常被视为自噬启动的标志蛋白。接下来，自噬的组装依赖于Atg7、Atg12和Atg5等，Atg12可以被Atg7激活并结合在Atg5上，形成复合物参与自噬体的组装。在自噬体伸展扩张期间，细胞质型的LC3-I会发生裂解，继而结合磷脂酰乙醇胺形成自噬小体膜型的LC3-II，故研究中通常将LC3染色作为自噬标记物，将LC3-II/LC3-I比值用于评估自噬水平的高低。最后在自噬晚期，p62与LC3-II结合并作为自噬底物在溶酶体内被降解，因此，p62常被看做自噬体降解的重要指标，最后在LAMP2调节下自噬完成[31]。整个过程称为自噬通量。

自噬受多种分子信号调节，如mTOR(雷帕霉素激酶的调节靶点)，它是自噬的主要负调节因子。而AMP依赖的蛋白激酶(5′AMP-activated protein kinase, AMPK)和PI3K则是两种常见促进自噬的激酶。

4 自噬途径参与纳米材料的毒性作用

近几年，随着对自噬认识的深入，研究者们发现自噬紊乱参与了纳米材料的毒性作用[32]。研究指出，大量纳米材料的作用过程均有自噬参与，且纳米材料的不同大小或浓度会产生不同的自噬反应[33-34]。自噬途径在纳米材料毒性机制中的表现是双向的，一方面，部分纳米材料可在细胞内积累，并通过干扰囊泡运输和细胞骨架形成来影响自噬通量，并降低或抑制溶酶体的稳定性和酶活性，最终导致自噬受阻，纳米材料诱导的自噬阻滞的结果可能是受损DNA、蛋白质和细胞器的累积[35-37]。另一方面，部分纳米材料可以激活细胞自噬途径，增加细胞自噬通量，并引导细胞死亡[34,38]。

4.1 纳米金属及金属氧化物

Ma等[39]发现纳米Au通过诱导自噬体在细胞内积累，同时阻断p62的降解并阻断自噬通量。Khan等[40]证实纳米氧化铁(Fe3O4)的细胞毒性也是依赖于自噬体的积累及自噬通量的异常阻断。此外，在缺氧情况下，进入细胞的纳米Au增加并诱导过度自噬聚集在巨噬细胞中，引起细胞死亡率增加，诱导巨噬细胞炎性小体活化，引起炎症反应[41]。Eri等[42]发现纳米Ag和纳米钯可通过诱导溶酶体损伤和自噬功能障碍来激活NLRP3炎症小体造成口腔黏膜上皮细胞出现苔藓样病变。

多项研究证实，纳米ZnO诱导细胞死亡的主要途径之一就是自噬，如纳米ZnO可诱导大鼠气管上皮细胞发生自噬导致其细胞损伤，且其对自噬的影响比SWNTs更明显，毒性作用更强[43]。纳米TiO2可以通过激活自噬对大鼠星形胶质细胞产生毒性作用[44]。此外，纳米CuO、纳米氧化铝(Al2O3)等均通过激活自噬而发挥细胞毒性作用[45]。纳米钽对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的毒性作用也是通过激活自噬造成的[46]。

4.2 碳纳米材料

碳纳米材料主要由一个或多个尺寸在100 nm以下的碳组成。目前，碳纳米材料包括但不限于碳量子点、纳米炭黑、富勒烯、纳米金刚石，以及最新的石墨烯。其中，富勒烯是碳纳米颗粒中最成熟的一种，而石墨烯则被认为是具有划时代意义的一种新材料，均是目前的研究重点与热点[47]。

根据国际提纯及化学应用联盟(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)的定义，富勒烯包括C60、SWNTs和MWNTs等[48]。在细胞毒性方面，研究发现SWNTs、MWNTs、氧化石墨烯等纳米材料会增加细胞内LC3-II蛋白的表达，同时p62表达也会增加，出现自噬体积累并阻止自噬通量的现象[17,43,49-50]。功能化MWNTs可以通过抑制mTOR激活自噬造成NR8383大鼠肺泡巨噬细胞存活率降低[51]。C60暴露的贻贝中，LC3B蛋白增强，溶酶体/细胞质体积比增加，最终导致对贻贝的毒性作用[52]。

氧化石墨烯纳米片通过激活自噬水平，造成骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞存活率降低，细胞周期阻滞，且其毒性作用存在剂量依赖性[53]。氧化石墨烯纳米颗粒导致的自噬体异常积累与Toll样受体途径(toll-like receptor, TLR)的调节密切相关[54]。

4.3 量子点

量子点(quantum dot, QD)是一种半导体纳米材料，它由周期表中Ⅲ～Ⅳ或Ⅵ化学元素族的化学元素组成，其尺寸一般在1～10 nm。由于其在荧光和光学稳定性方面的优越性，QD被认为在生物医学领域具有潜在的诊断和治疗手段[55-57]。然而，QD对人体健康的潜在威胁阻碍了量子点在生命医学科学中的广泛应用。现有研究指出，自噬在QD造成细胞毒性中起着重要作用。

Stephan等[58]证实以硒化镉(CdSe)和磷化铟镓(InGaP)为核心的两种QD可以通过诱导自噬造成猪肾近端小管细胞的毒性作用，并指出诱导自噬可能是部分纳米材料的共有特性。石墨烯量子点(GQD)可以通过激活p-p38MAPK激活自噬进而促进肺癌A549细胞的死亡[59]。此外，CdSe/ZnS量子点暴露会通过提高自噬水平，进而损害精母细胞的修复，导致细胞凋亡和精子产量下降[60]。

4.4 其他纳米材料

自噬功能障碍被认为是对纳米材料的主要细胞毒性反应。据报道，纳米二氧化硅(SiO2)通过调节CDK7-CDK4级联诱导过度自噬导致自噬功能障碍进而引起毒性作用[61]。PAMAM聚酰胺树枝状大分子通过诱导自噬体积累，阻断自噬通量杀伤细胞[62]。黑磷(black phosphorus, BP)纳米片属于二维材料家族的新成员，研究发现其可以通过抑制自噬，增强细胞炎症反应，进而对巨噬细胞以及肝细胞造成毒性作用[63]。

5 结语

随着材料科学的发展，新型纳米材料的出现使人们越来越关注其安全性。但纳米材料的毒性评价远远落后于材料应用的发展，其毒性作用的具体机制尚未明确，尤其需要注意纳米材料体内外毒性与临床的差异性，如何确定人们生活中接触的纳米材料的安全浓度，是当前社会的迫切需要。未来的研究应该努力解决目前细胞毒性测试中的不足，并利用这些发现去设计改进纳米材料，最终使其能更为安全地应用于人们的生活。