淫羊藿骨碎补联合骨营养补剂对骨质疏松大鼠的影响

王旭东，赵宏宇 ，邸 琳，刘新宇，张凤清,

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012；2.吉林省中医药科学院，吉林长春 130012）

骨质疏松是由于骨质流失、骨密度降低、骨组织显微结构退化导致骨的脆性增高及负钙平衡的一种全身骨病[1]。骨质疏松表现为骨骼疼痛、易于骨折[2]。骨密度是反映骨质量的一个重要标志，可以反映骨质疏松程度[3]。中国大陆地区40 岁以上中老年人群中骨质疏松的患病率约为24.6%，并且骨质疏松对患者的生命质量影响极大[4]。因此，研究一款增加骨密度的保健食品具有非常重要的意义。

在中医理论中，鹿骨具有补虚羸，强筋骨等功效[5]。淫羊藿，性辛甘而温，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿作用[6]。骨碎补，性温而补，具有补肾强骨、续伤镇痛功效[7]。现代医学研究表明，氨基葡萄糖盐酸盐具有良好的生物和化学稳定性、提升补钙效果[8]。硫酸软骨素具有稳定软骨基质，保护软骨作用，促进新的软骨组织的形成，降低软骨面的退变[9]。碳酸钙可提供骨生长所需的营养物质，减少骨中钙质沉积[10]。基于这些科学理论，实验室拟开发一种可以增加骨密度的保健食品，将具有增加骨密度的中药材和骨营养剂联合使用，探讨淫羊藿骨碎补鹿骨粉联合骨营养剂对增加骨密度功能的影响，为增加骨密度、改善骨质疏松症功能的保健食品或药品提供了重要的实验依据。

本实验将淫羊藿和骨碎补进行水提，浓缩干燥制成淫羊藿骨碎补提取物，测定淫羊藿骨碎补提取物中主要功效成分的含量。以去卵巢所致骨质疏松大鼠为研究对象，在服用各自受试物12 周后，测定各组大鼠股骨密度和骨钙含量并进行股骨病理学检查。观测中药组、营养剂组和复方组能否具有增加骨密度、改善骨质疏松的功效，进一步对比复方组与中药组和营养剂组的效果，以期为骨质疏松症相关保健食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级SD雌性大鼠，体质量180～220 g，48 只，动物及饲料 长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（吉）-2018-0007，由吉林省中医药科学院实验动物伦理委员会审核通过，符合实验动物伦理委员会规定；淫羊藿 安国市安兴中药有限公司，批号：190301；骨碎补 河北国松堂制药有限公司，批号：318 080001；鹿骨粉 长春世鹿鹿业有限公司，批号：20 180512；氨基葡萄糖盐酸盐浙江金壳药业有限公司，批号：M-AT-1 904020；硫酸软骨素 嘉兴恒杰生物制药有限公司，批号：HS1 904270；碳酸钙 南通励成生物工程有限公司，批号：20 190115；芦丁标准品（批号：100080-201811）、淫羊藿苷标准品（批号：110737-201516）中国食品药品检定研究院；注射用青霉素钠 华北制药股份有限公司，批号：F9 027101；戊酸雌二醇片DELPHARMLilleS.A.S，批号：469A。

HHS型水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KFL-400 纯水机 凯弗隆科技有限公司；KP5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-5500PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；YP10001 大鼠秤 上海佑科仪器仪表有限公司；XTL-340E体式显微镜 上海长方光学仪器有限公司；Ultra Focus双能X射线小动物骨密度仪 美国Faxitron公司产品；1100 型高效液相色谱仪，配有自动进样器、四元泵、柱温箱、脱气机和二极管阵列检测器 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 淫羊藿骨碎补提取物的制备 在预实验中，分别以料液比、提取次数和提取时间为考察因素，设计三因素三水平试验，得出最优工艺为料液比1:14，提取次数3 次，提取时间为1.5 h。取淫羊藿和骨碎补各900 g，加入14 倍量的水，25 ℃预浸30 min，水提3 次，每次提取1.5 h，合并滤液，浓缩干燥，粉碎，得淫羊藿骨碎补提取物，出膏率为17.3%。

1.2.2 淫羊藿骨碎补提取物中淫羊藿苷和总黄酮含量测定

1.2.2.1 淫羊藿苷的含量测定 对照品溶液的制备：精密称取淫羊藿苷标品适量，用甲醇溶解并配制成0.1 mg/mL的对照品溶液，备用。

样品溶液的制备：取1.2.1 中的提取物粉末0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇40 mL，称定重量，超声处理1 h（温度为25 ℃），冷却至室温，用稀乙醇补足重量，取续滤液，备用。

样品测定：利用高效液相色谱对淫羊藿苷进行检测，流动相为乙腈:水（30:70），检测波长为270 nm，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min，进样量为10 μL[11]。

1.2.2.2 总黄酮的含量测定 芦丁标准溶液的制备：精密称取芦丁标品适量，加甲醇制成每1 mL含芦丁150 μg的溶液，备用。

标准曲线绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL相当于芦丁0、75、150、300、450、600 μg移入10 mL比色管中，加入30%乙醇定容至5 mL，各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，振摇后放置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，用30%乙醇定容至刻度，以零度管为空白，摇匀后用1 cm的比色杯，在510 nm处测定吸光值，绘制芦丁含量（μg）与吸光值（A）的标准曲线。

样品处理：称取1.2.1 中的提取物粉末1 g，用滤纸包紧，置于平底烧瓶中，加入100 mL 70%乙醇溶液，浸润后，在80 ℃水浴下回流2 h，洗涤滤渣，合并滤液。在50 ℃下减压蒸馏，直至烧瓶内无醇味，倒出溶液，并用热水洗涤烧瓶，合并溶液，以75 mL氯仿分3 次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液，于50 mL容量瓶定容。吸取上述水溶液2 mL，沿聚酰胺树脂层析柱慢慢滴入，静置10 min，待测液被充分吸附后，用70%乙醇洗脱，流速为1 mL/min，至流出液基本无色，收集于20 mL容量瓶，定容后用于测定。

样品测定：利用紫外分光光度计测定总黄酮，取1 mL待测液按标准曲线制备操作步骤于510 nm处进行吸光度的测定[12]。

1.2.3 动物去势模型制备及分组给药 48 只SD雌性大鼠，选40 只进行双侧卵巢摘除手术，以戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，肋骨下沿至骨盆上沿位置除毛备皮，碘伏消毒，在距离肋骨下沿2 cm，距离脊柱2 cm的脊柱两侧，分别切开1 cm大小皮肤层切口，从皮肤切口下操作，切开小于1 cm的腹腔壁肌肉层切口，切口视野达到腹腔，拉出卵巢脂肪团，结扎卵巢与子宫连接部，摘除双侧卵巢，腹腔壁肌肉层和皮肤层分层缝合，消毒伤口。其余8 只作为假手术组，大鼠按照去势手术方法处理，但保留双侧卵巢，仅切除部分脂肪。术后及连续3 d，肌注青霉素（4×104U/kg），以防感染。术后3 d，将40 只雌性SD大鼠随机分为5 组：模型组、阳性药组、中药组、营养剂组、复方组。

将各组药物分别灌胃，大鼠的灌胃剂量为人体推荐量的10 倍（人体质量以60 kg计），阳性药组灌胃剂量为戊酸雌二醇片1.0 mg/kg·bw；中药组的灌胃药物剂量为淫羊藿骨碎补提取物0.17 g/kg·bw，鹿骨粉0.08 g/kg·bw；营养剂组灌胃药物剂量为氨基葡萄糖盐酸盐0.17 g/kg·bw，硫酸软骨素0.08 g/kg·bw，碳酸钙0.17 g/kg·bw；复方组灌胃药物剂量为淫羊藿骨碎补提取物0.17 g/kg·bw，鹿骨粉0.08 g/kg·bw，氨基葡萄糖盐酸盐0.17 g/kg·bw，硫酸软骨素0.08 g/kg·bw，碳酸钙0.17 g/kg·bw。假手术组和模型组大鼠经口给予0.5%羧甲基纤维素溶液，受试样品均用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液配制。灌胃溶液的体积均为10 mL/kg·bw，1 次/d，连续灌胃12 周，每周称量体重并按体重调整灌胃量。

1.2.4 动物处理及测定指标

1.2.4.1 动物处理 大鼠末次灌胃1 h后以10%水合氯醛溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血后处死大鼠，取出双侧股骨，其中左侧股骨用于骨密度测定，之后于105 ℃干至恒重，精密称重，记录数值，用于骨钙测定，右侧股骨用于骨组织病理学检查。

1.2.4.2 骨密度测定 将左侧股骨摆放在生物学X射线小动物骨密度仪的吸收测量平台上，直接扫描左侧股骨骨密度。

1.2.4.3 骨钙测定 大鼠左侧股骨灰化，然后加酸消化，用EDTA滴定法测骨钙含量。

1.2.4.4 骨组织病理学检查 病理组织学检查，剥离大鼠右侧股骨迅速放入10%福尔马林固定，氯化铝法脱钙，石蜡包埋、切片，HE染色，茜素红S染色光镜观察。

观察指标：HE观察指标：骨皮质（增厚、变薄、疏松），骨小梁（减少、变细、疏松、断裂），软骨退变及其他改变；茜素红S染色观察指标：钙质沉积呈橘红色，其它呈复染色（淡绿）。

评分标准：

a：“0”分表示HE染色结果基本正常，或是茜素红S染色阴性；

b：“1”分表示HE染色结果偶见轻微病变，或是茜素红S染色疑似阳性；

c：“2”分表示HE染色结果轻度病变，或是茜素红S染色弱阳性，范围≤1/4 视野；

d：“3”分表示HE染色结果中度病变，或是茜素红S染色中等阳性，范围≤1/2 视野；

e：“4”分表示HE染色结果重度病变，或是茜素红S染色强阳性，病变范围≥3/4 视野；

f：如观察结果在“0～1”之间，则可记为“0.5”分，依次类推。

1.3 数据处理

采用Origin 8.0 作图，采用SPSS 20.0 进行数据分析，各数值用均数X±S表示。组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿骨碎补提取物中的淫羊藿苷、总黄酮含量测定结果

经1.2.2.1 中的方法检测淫羊藿苷的含量，以淫羊藿苷含量（mg/mL）与峰面积的标准曲线为y=11389x−37.65，R2=0.9994，淫羊藿苷含量为0.78%，淫羊藿苷对照品和淫羊藿骨碎补提取物的色谱图如图1 所示；经1.2.2.2 中的方法检测总黄酮的含量，以芦丁含量（mg/mL）与吸光值（A）的标准曲线为y=11.887x+0.0015，R2=0.9993，总黄酮的含量为4.38%。

图1 淫羊藿苷对照品（a）和淫羊藿骨碎补提取物（b）色谱图Fig.1 Chromatograms of icariin reference substance (a) and Epimedium Rhizoma Drynariae extract (b)

2.2 各组药物对大鼠体重的影响

由表1 可知，各组大鼠初始体重差异无统计学意义（P>0.05），模型组从第4 周开始，体重均显著高于假手术组（P<0.01），大鼠体重异常改变的原因可能是由于卵巢被切除后雌激素合成迅速减少，从而引起激素水平紊乱。雌激素可抑制脂肪的合成代谢，因此雌激素水平降低后出现脂肪沉积的现象，进而造成体重增加[13−16]。与模型组相比，阳性药组的每周体重和体重增重均显著降低（P<0.01 或P<0.05）；与模型组相比，中药组和复方组的体重增重均显著增加（P<0.05），表明包含中药材的受试物可能对于大鼠体重增加有一定影响。

表1 各组药物对大鼠体重的影响Table 1 Effect of each group of drugs on the body weight of rats

2.3 各组药物对大鼠股骨干重/体重、骨密度、骨钙含量的影响

由表2 可知，与假手术组相比，模型组的股骨干重/体重、骨密度、骨钙含量均极显著降低（P<0.01），即大鼠骨密度低下模型造模成功；与模型组相比，阳性药组的股骨干重/体重极显著增加（P<0.01），骨密度和骨钙含量显著增加（P<0.05），表示阳性药组药物有效；与模型组相比，中药组、营养剂组的骨钙含量和骨密度未见显著性差异（P>0.05），复方组中骨钙含量和骨密度值均有显著增加（P<0.05）；与模型组相比，其他组的股骨干重、股骨干重/体重均未见明显差异（P>0.05），结果表明复方组相较中药组和营养剂组，效果更加显著。各组大鼠股骨骨密度扫描图片见图2。

图2 各组大鼠股骨骨密度扫描图片Fig.2 Scanning pictures of femur bone mineral density of rats in each group

表2 各组药物对大鼠股骨的重量、骨钙及骨密度的影响Table 2 Effect of each group of drugs on the weight,bone calcium,and bone density of rat femur

2.4 骨组织病理学观察

股骨病理学检查结果见图3，结果显示假手术组骨小梁分布面积较大，骨小梁连续、完整，彼此连接，间隔内多见造血组织成分分布，少见脂肪成分，骨小梁粗壮，呈网状分布，镜下分布数量多（图3a）。模型组骨小梁分布面积减少，主要集中在股骨干骺段，多已断裂，无完整的，切面较细，间隔增加，分布造血组织成分减少，可见脂肪组织增多（图3b）。与假手术组比较，模型组骨小梁成分减少，骨小梁稀疏，变细、断裂，结构紊乱，表明骨质疏松造模成功。阳性药组与模型组比较，骨小梁成分增加，骨小梁稀疏，变细、断裂的程度减轻（P<0.01），有效减轻了骨质疏松的程度，增加了骨小梁成分（图3c）。中药组与模型组比较，骨小梁成分有所增加，骨小梁稀疏，变细、断裂的程度有所减轻，可以减轻骨质疏松的程度（图3d）。营养剂组与模型组比较，骨小梁稀疏，变细、断裂的程度有所减轻，缓解了骨质疏松的程度（图3e）。复方组与模型组比较，骨小梁成分增加，骨小梁稀疏，变细、断裂的程度减轻（P<0.01），有效减轻了骨质疏松的程度，增加了骨小梁成分（图3f）。

图3 各组药物对假手术大鼠、去卵巢大鼠股骨病理学影响Fig.3 Effect of each group of drugs on pathology of femur in sham-operated rats and ovariectomized rats

茜素红S染色观察：钙质沉积呈橘红色，其它呈复染色（淡绿）。依据评分标准，对股骨染色结果进行评分，统计结果见表3 与表4。

表3 动物股骨组织常规染色观察结果Table 3 Observation results of routine staining of animal femur tissue

表4 动物股骨组织茜素红S染色观察结果Table 4 Observation of alizarin red S staining in animal femur

3 讨论与结论

常见的骨质疏松症为原发性骨质疏松症。主要分为绝经后骨质疏松症（Ⅰ型）和老年性骨质疏松症（Ⅱ型）[17]。其中，绝经后骨质疏松症主要是由于自然绝经或卵巢切除后导致体内雌激素含量下降而引起骨量丢失的症状。雌激素的抗骨吸收作用可能与其抑制成骨细胞凋亡和促进破骨细胞凋亡有关，但其机制尚未完全清楚[18]。老年性骨质疏松症一般指老人70 岁后发生的骨质疏松，表现为“低转换”型骨质疏松，主要是由于老年人骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化受抑制，成骨细胞分裂增殖缓慢，骨形成因子合成代谢受阻，活性衰退致骨形成期延长，骨形成率降低，同时破骨细胞对骨的吸收增强，使骨重建处于负平衡，骨量丢失[19]。

依中医理论，以淫羊藿其补肾阳，益肾精之功而为君药。以鹿骨主治虚劳骨弱之功作为本方中的臣药。以骨碎补其补益肝肾，又可活血祛瘀之功为佐使药。诸药同用，重在补益肾精，温壮肾阳，使精血充盈，髓海充盛，骨髓得养，而使筋骨强健。同时，又发挥其活血祛瘀之能，使之补而不滞，补力更强。科学研究表明，淫羊藿苷是通过促进成骨细胞的生成和活化[20−21]，抑制破骨细胞的形成来缓解骨质疏松[22]。淫羊藿总黄酮是通过促进骨组织中OPG mRNA的表达来抑制破骨细胞的分化与成熟，从而治疗骨质疏松[23]。鹿骨中含有骨胶原、蛋白质、软骨素、磷脂质和磷蛋白，利于促进骨形成，促进体内胶原蛋白及弹性蛋白的更新，抑制骨吸收，促进软骨内骨化等过程[24]。骨碎补总黄酮通过改善骨质疏松的超微结构及脯氨酸羟化程度，从而为骨质疏松的防治研究提供思路[25]。

氨基葡萄糖可以通过刺激黏多糖的合成来增加骨钙的摄取量，提高骨与软骨组织的吸收和代谢，亦能改善滑膜液的粘稠度。氨基葡萄糖也是蛋白多糖合成的基本物质，可以作用于关节软骨，恢复软骨细胞的代谢功能，刺激软骨细胞产生蛋白多糖，也可抑制损伤软骨的酶如胶原蛋白酶和磷脂酶A2 的活性[26−27]。硫酸软骨素通过抑制丝裂原活化蛋白激酶p38MAPK和信号调节激酶ERK1/2 的活性，降低核转录因子kappa B的核易位，降低蛋白水解酶、炎症诱导酶以及促炎细胞因子的合成来发挥作用[28]。氨基葡萄糖和硫酸软骨素联合作用能促进人关节软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成，降低软骨细胞死亡，保持软骨细胞外基质的合成与分解的代谢平衡[29]。据报道，硫酸软骨素、碳酸钙也具有补充和促进骨钙吸收的作用[30−31]。因此，通过上述一系列作用机理，氨基葡萄糖和硫酸软骨素可以保护关节软骨细胞，控制骨质疏松症增加骨密度。

本实验将具有增加骨密度功效的中药材和骨营养剂联合使用，探讨淫羊藿骨碎补鹿骨粉联合骨营养剂对增加骨密度功能的影响。是以中医理论为指导，选用益肾精、补肾、强筋骨中药：鹿骨、淫羊藿、骨碎补为根本，配合其他营养物质（氨基葡萄糖盐酸盐、碳酸钙），及保护软骨的硫酸软骨素组成，起到既治标又治本，促进钙吸收的组方思路。实验结果表明，复方组具有增加大鼠骨密度和骨钙含量的作用，与模型组相比，复方组可以增加骨小梁成分，减轻骨小梁稀疏，变细、断裂的程度，有效减轻骨质疏松的程度，增加骨小梁成分。并且，与复方组相比，中药组和营养剂组对于骨小梁成分同样有所增加，骨小梁稀疏，变细、断裂的程度同样有所减轻，但是增加骨密度和骨钙效果并不显著，实验结果证明复方组比单用中药或营养剂效果更加显著。本研究为增加骨密度、改善骨质疏松症功能的保健食品或药品提供了重要的理论基础，并且建议多关注中医理论和现代医学的结合。但本实验所用药材提取物为粗提物，复方的具体作用机制还有待于今后从分子水平、体外实验等进一步阐明。