非晶化甲壳素脱乙酰制备高脱乙酰度壳聚糖

许 磊，张文昌，赵 岩，张劲松

（中国科学院金属研究所，沈阳材料科学国家研究中心，辽宁沈阳 110016）

甲壳素（Chitin）由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4 糖苷键聚合而成，是自然界第二丰富的有机天然多糖，广泛存在于虾、蟹等甲壳动物以及蘑菇等菌类的细胞壁中[1]。甲壳素及其衍生物具有无毒性、生物相容性和生物可降解性等多种优良性能，在食品、生物医药、材料、农业、纺织印染等领域具有广泛的应用前景[2−5]。由于甲壳素具有高度有序的晶体结构和大量的分子间和分子内氢键，难溶于水和常见的有机溶剂，其应用受到了很大的限制[6]。壳聚糖（Chitosan）是甲壳素的脱乙酰产物，是甲壳素最重要的衍生物之一，可溶解于部分稀酸中，其应用比甲壳素更为广泛[7−8]。壳聚糖的脱乙酰度（Degree of Deacetylation，DD）直接影响其溶解度、粘度、离子交换能力和絮凝性等性能，是评价壳聚糖质量的重要技术指标之一。高脱乙酰度（DD>90%）的壳聚糖不仅溶解和离子交换性能良好，还具有更优良的抑菌性[9−10]和生物相容性[11]，主要应用于可食用膜[12−13]和生物医用材料[14−15]等领域，因此高脱乙酰度壳聚糖具有更高的商业价值。目前壳聚糖主要通过甲壳素非均相脱乙酰反应制备。影响壳聚糖脱乙酰度的参数主要包括反应温度、NaOH浓度和碱处理方式（处理次数）等[16]。通常为了获得高脱乙酰的壳聚糖，需要采用碱多次处理的方式[17−18]，其制备工艺更为复杂。

超微粉碎（Superfine grinding）技术利用机械或流体动力的方法克服物料内部凝聚力使之破碎，将粒径3 mm以上的物料粉碎至100 μm以下，广泛应用于食品[19−21]、化工[22]、医药[23−24]等领域，超微粉碎制备的超细粉具有良好的溶解性、分散性、化学反应活性等特殊性能[25]。甲壳素经超微粉碎处理后，其粒度和结晶度均明显降低[26]。本研究以超微粉碎处理得到的甲壳素细粉为原料，非均相脱乙酰制备壳聚糖，利用超微粉碎细粉良好的化学反应活性，提高甲壳素非均相脱乙酰反应的效率，减少反应过程中碱的用量（减少排放）和简化高脱乙酰度壳聚糖的制备工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

α-甲壳素 大连中科格莱克生物科技有限公司，来源于阿拉斯加雪蟹（粘均分子量Mv=535 kDa，脱乙酰度DD=8.32%）；其他试剂 均为AR级。

ZNC-300X碾磨式超微粉碎机 中科耐驰技术（北京）有限公司；Bettersize2600 激光粒度分布仪 丹东百特仪器有限公司；D/max-2500PC X射线衍射仪 日本理学电机（RIGAKU）株式会社；101 型电热鼓风干燥箱 北京市光明医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甲壳素的超微粉碎 先将甲壳素用普通粉碎机进行粗粉碎，过筛得到60 目甲壳素（命名为cht-0）。然后取400 g cht-0 置于碾磨式超微粉碎机的碾磨腔中进行超微粉碎。超微粉碎机的转速设置为40 r/min，电流设置为2.5 A，每隔15 min，收集适量样品，用于后续的测试和脱乙酰反应研究。根据碾磨时间（15、30、45 和60 min）的不同，总共收集得到4 种甲壳素细粉，依次命名为cht-1、cht-2、cht-3 和cht-4。

1.2.2 甲壳素细粉的XRD（X射线衍射）和粒径分析

甲壳素细粉（cht-1～cht-4）和60 目甲壳素（cht-0）的XRD采用X射线衍射仪测定。衍射条件为Cu Kα辐射源（λ=0.1542 nm），采用石墨单色器对射线束进行单色化，管电压为50 kV，管电流200 mA，扫描步长为0.02 °，扫描范围5～60 °。甲壳素样品的结晶度按照Ioelovich[27]的方法计算。

甲壳素细粉（cht-4）的粒径使用激光粒度分布仪测定。将2 mg样品放入30 mL蒸馏水中，超声充分分散，然后逐滴加入至充满蒸馏水的样品池中。通过控制折光率来调节加入的样品量，折光率控制在10%～13%，循环水的循环速度为600 r/min。

1.2.3 甲壳素非均相脱乙酰反应制备壳聚糖及反应动力学分析 参考Chang等[28]的方法，具体如下：分别取上述得到的甲壳素粉末（cht-0～cht-4）5 g，放置于100 mL圆底烧瓶中，然后加入50 mL 40wt%的NaOH溶液（甲壳素粉末和NaOH溶液的料液比为1:10），待甲壳素分散均匀后置于一定温度（90、95 和100 ℃）的油浴锅中，进行非均相脱乙酰反应。在反应时间为1、2、3 和4 h取出适量的反应物，立即倒入装有200 mL蒸馏水的烧杯中，使脱乙酰反应停止。反应物用布氏漏斗抽滤，固体部分先用蒸馏水洗涤3 次，再用无水乙醇洗涤2 次，最后60 ℃烘干，得到壳聚糖。

1.2.4 壳聚糖脱乙酰度的测定 采用双突跃电位滴定法[29]测定壳聚糖的脱乙酰度，计算公式如下：

其中：G：壳聚糖样品（130 ℃充分干燥）的质量（g）；C：NaOH的浓度（mol/L）；V1：第一突跃点时用去的NaOH标准溶液的体积（mL）；V2：第二突跃点时用去的NaOH标准溶液的体积（mL）；203：N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的相对分子质量；42：乙酰基的相对分子质量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 超微粉碎甲壳素的制备和分析

采用XRD分析了甲壳素粉末（cht-0～cht-4）的结晶行为，其谱图见图1。由图1 可知，随着超微粉碎处理时间的增加，甲壳素在9.2 °处的（020）面和19.2 °处的（110）面的两个特征尖峰的强度逐渐降低，说明其微观结构已经破坏[30]。甲壳素粉末cht-0 的结晶度经计算为96.14%，随着超微粉碎处理，甲壳素的结晶度逐渐降低，最后得到的甲壳素细粉cht-4 的结晶度仅为8.09%，接近于完全非晶化的甲壳素。结晶度降低的原因是碾磨削弱了甲壳素的氢键网络[31]。

图1 甲壳素粉末（cht-0～cht-4）的XRD谱图Fig.1 XRD pattern of chitin samples (cht-0～cht-4)

采用激光粒度分布仪分析甲壳素细粉cht-4 的粒径分布，其粒径分布图见图2（其中累积分布表示小于某颗粒粒径的百分含量；区间分布表示粒径区间中某颗粒的百分含量）。甲壳素细粉cht-4 的体积平均径为41.44 μm，小于60 目甲壳素cht-0 粒径（250 μm）的五分之一，90%的粒径低于96.33 μm，已达到超微粉碎的级别。

图2 甲壳素样品cht-4 的粒径分布图Fig.2 Particle size distribution pattern of chitin sample cht-4

2.2 甲壳素非均相脱乙酰制备壳聚糖

不同反应温度和反应时间得到壳聚糖产品的脱乙酰度见表1。由表1 可知，随着甲壳素样品结晶度的降低，在相同的反应条件下（反应温度和时间），其制备的壳聚糖的脱乙酰度更高。其中非晶化程度高的甲壳素细粉cht-3 和cht-4，经单次碱处理即可得到脱乙酰度90%以上的壳聚糖，可以大幅降低整个脱乙酰过程中碱的用量，简化生产工艺。

表1 不同反应温度和反应时间得到壳聚糖的脱乙酰度（%）Table 1 Degree of deacetylation of chitosan obtained at different reaction temperature and time（%）

2.3 反应动力学分析

甲壳素的非均相脱乙酰反应是与NaOH和乙酰氨基的浓度相关的二级反应，但由于NaOH是远过量的，通常认为甲壳素的脱乙酰反应为准一级反应[32]（只与乙酰氨基的浓度相关），速率常数与脱乙酰度的关系可以表示为：

式中：DD为反应产物的脱乙酰度（%）；t为反应时间（min）；k为反应速率常数（min−1）。

分别对不同结晶度的甲壳素在90、95 和100 ℃反应温度下的脱乙酰产物的−ln(1−DD)对反应时间t作图，得到图3，图中直线的斜率即为甲壳素的脱乙酰反应速率，表观一级反应速率常数见表2。

表2 甲壳素脱乙酰反应的表观一级反应速率常数Table 2 Apparent first order rate constants of deacetylation of chitin

图3 甲壳素（cht-0～cht-4）在不同反应温度下−ln（1−DD）随反应时间的变化Fig.3 Variation of -ln (1-DD) with reaction time for chitin(cht-0～cht-4) at different reaction temperatures

根据阿伦尼乌斯（Arrhenius）公式计算甲壳素的脱乙酰活化能：

式中，k为反应速率常数；Ea为反应活化能（J/mol）；R为通用气体常数，8.314 J/(mol·K)；T为热力学温度（K）。

分别对不同结晶度的甲壳素的ln k对-1/RT作图，即可求得反应的活化能。如图4 所示，甲壳素（cht-0～cht-4）对应的脱乙酰反应活化能分别为58.17、47.23、42.30、35.44 和31.73 kJ/mol，表明随着甲壳素样品结晶度的降低，其非均相脱乙酰的反应活性增强。

图4 甲壳素（cht-0～cht-4）的脱乙酰反应ln k随-1/RT的变化Fig.4 Variation of ln k in the deacetylation reaction of chitin (cht-0～cht-4) with -1/RT

2.4 非晶化对甲壳素非均相脱乙酰反应的影响分析

根据文献[28,33−34]报道，甲壳素分子链表面的NaOH的浓度是影响脱乙酰效率的主要因素（甲壳素脱乙酰反应历程如图5 所示，其中第（1）步反应是可逆过程，需要克服一定的活化能，是整个反应的控速步骤[35]）。随着脱乙酰反应的进行，NaOH能与低分子电解质（脱乙酰产物）以及多糖分子会形成溶剂化结构，导致甲壳素分子链表面NaOH的浓度降低，脱乙酰反应难以继续进行[36]。因此，即使提高NaOH的浓度和反应温度，也很难直接得到高脱乙酰度壳聚糖。通常需要多次碱处理减少低分子电解质的含量和溶剂化结构，来实现高脱乙酰度壳聚糖的制备[17−18]。

图5 甲壳素非均相脱乙酰反应历程Fig.5 Heterogeneous deacetylation process of chitin

甲壳素经超微粉碎非晶化处理后，结晶度的降低提高了反应产物的扩散速度，有利于乙酰基的脱落和低分子电解质向溶剂中运输，减少反应过程中形成的溶剂化结构，减缓甲壳素分子链表面NaOH的浓度降低速率，从而提高脱乙酰反应的效率（降低反应活化能）。非晶化程度高的甲壳素样品（cht-3、cht-4）经单次碱处理，即可得到高脱乙酰度（DD>90%）壳聚糖。

3 结论

高脱乙酰度壳聚糖通常需要采用甲壳素经多次碱处理的工艺制备。本研究提供了一种通过超微粉碎处理甲壳素，使其非晶化后再脱乙酰制备壳聚糖的技术路线。非晶化程度高的甲壳素，经过单次碱处理即可得到高脱乙酰度（DD>90%）壳聚糖，可以大幅降低脱乙酰反应过程中碱的用量，简化生产工艺，具有良好的应用前景。