发酵型牦牛乳清酒的工艺优化

毛 婷，祁宏山，季 彬,，郑 群，郭 琪，穆永松，毛雪琴，王治业,

（1.甘肃省科学院生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃兰州 730000；2.甘肃华瑞农业股份有限公司，甘肃张掖 734500；3.青海金祁连乳液股份有限公司，青海祁连 810400）

2009 年，我国正式推出《奶酒》的国家标准GB/T 23546-2009[1]，乳清酒属于奶酒中的一种，是指以乳清液、乳清粉等为主要原料，经发酵等工艺酿制而成的饮料酒。我国大多数奶酪企业产量小，乳清的排放量不是很多，但将乳清直接排放会造成资源的浪费及环境的污染，利用乳清液提取乳清粉、乳清蛋白或乳糖所需要的设备技术成本较高，而且利用的并不是全部的乳清成分。乳清中约含水95%，乳糖3%～4%，乳清蛋白0.3%～0.7%，乳酸1%，柠檬酸<0.2%，除此之外还含有多种维生素和矿物质及微量元素[2−4]，利用乳清发酵制成酒可完全利用乳清中的营养成分，减少资源的浪费。牦牛是我国青藏高原牧区特色牲畜之一，牦牛乳与其他普通牛乳相比，β-乳球蛋白、血清白蛋白及矿物质含量都较高，是营养价值极高且稀缺的国内高端乳源[5]，而牦牛乳清中营养成分也高于其他普通乳清，利用牦牛乳清发酵制备，可获得营养丰富的牦牛乳清酒。

传统的奶酒生产都是采用“先乳酸发酵后酒精发酵”工艺制备低度数乳清酒[6]，利用乳酸菌分解乳糖产生乳酸，但发酵过程中乳糖利用不足会造成酒液度数偏低，发酵迟缓现象，因此传统的生产工艺很难生产出质量稳定的高品质奶酒[7−9]。制备≥10%Vol高度数的乳清酒，一种是采用蒸馏工艺制备成蒸馏型奶酒。Dagone等[10]利用乳酸克鲁维酵母连续发酵并采用蒸馏工艺，最终得到酒精度为35.4%Vol的蒸馏型乳清酒，但通过蒸馏后乳清中的营养物质部分流失。另一种是将乳清液与其他功能性含糖高物质混合发酵，提高发酵液中可发酵性糖含量。孙子羽等[11]通过在乳清液中添加黑枸杞，提高发酵液中可发酵性糖含量获得酒精度为12.3%Vol的黑枸杞乳清酒，但增加了黑枸杞汁制备工艺，工艺复杂，生产成本较高。

乳酸克鲁维酵母在好氧条件下可以充分利用乳糖产生酒精并散发水果的香味赋予酒体丰富的气味，但菌株耐酒精能力弱；酿酒酵母可以利用葡萄糖、蔗糖等发酵糖生产酒精但不能利用乳糖产酒精。因此，本试验采用乳酸克鲁维酵母及酿酒酵母进行两段式发酵并采用Box-Behnken试验设计建立数学模型，确定了一种发酵型牦牛乳清酒的工艺方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛乳清液 青海金祁连乳液有限公司；乳酸克鲁维酵母（CICC 1772）工业微生物菌种保藏中心；酿酒酵母（GSCII 32168）甘肃省工业微生物菌种保藏中心；麦芽粉 兰州黄河麦芽有限公司；三乙胺 国药集团化学试剂有限公司；正己烷 上海佰晔生物科技中心；斐林试剂 南京化学试剂股份有限公司；葡萄糖 上海萌桠生物科技有限公司；甲醛溶液 上海卡迈舒生物科技有限公司。

ULTIMATE高效液相分析仪 美国赛默飞有限公司；HE-WD-300 干燥箱 广州澳德玛电子科技有限公司；SKY-100C恒温摇床 上海苏坤实业有限公司；UV-6100S紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；MJ-150Ⅱ培养箱 上海一恒科技有限公司；DARO反渗透仪 西安迪奥环保科技有限公司；ZRN-PH-D型台式pH计 北京中瑞能仪表技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及培养条件 麦芽汁培养基：干麦芽粉与水按照质量比1:4 在50～60 ℃水浴锅中糖化3～4 h后煮沸，将煮沸的糖化液用4 层纱布过滤，取上清液121 ℃灭菌20 min后待用[12]。乳酸克鲁维酵母种子液：在无菌条件下将乳酸克鲁维酵母菌株以4%接种量接种于麦芽汁培养基，在28 ℃，200 r/min条件下培养18 h。酿酒酵母种子液：在无菌条件下将酿酒酵母菌株以4%接种量接种于麦芽汁培养基，在28 ℃，200 r/min条件培养下24 h。

1.2.2 工艺流程 牦牛乳清液→浓缩→接种（乳酸克鲁维酵母）→发酵→成分调整合并→接种（酿酒酵母）→发酵→过滤→冷却→包装→成品。

1.2.3 乳清液的浓缩 乳清液中乳糖含量为3.5%～4.5%，传统的浓缩和分离手段能耗太大，因此采用反渗透分离技术可以有效分离浓缩低浓度溶液。本研究采用芳香聚酰胺卷式反渗透膜、压力为0.5 MPa、温度为40 ℃进行乳清液的浓缩[13]以提高牦牛乳清中固形物的含量。检测不同浓缩倍数下乳清液中的乳糖含量及乳清浊度，确定乳清浓缩倍数。

1.2.4 发酵工艺条件优化

1.2.4.1 乳酸克鲁维酵母发酵 在浓缩后的乳清液中接入4%活化后的乳酸克鲁维酵母种子液，在30 ℃，200 r/min条件下培养，每隔6 h取样检测乳糖含量，当乳糖浓度≤1%时停止发酵，确定乳酸克鲁维酵母发酵时间，静置并排除酵母获得上清醪液待用。

1.2.4.2 酿酒酵母发酵 用0.1 mol/L NaOH溶液调整上述醪液pH，加入30%食品级白砂糖，同时接入活化后的酿酒酵母种子液，在200 r/min条件下培养24 h后静置培养，当发酵液中酒精度不再变化时可以判断为发酵结束，排除酵母，采用硅藻土过滤后降温至0 ℃保藏2 d，罐装后采用巴氏灭菌法在60 ℃灭菌30 min，即可得到成品牦牛乳清酒。在总接种量为5%，初始pH6.0，发酵时间24 h条件下研究不同发酵温度（16、20、25、30、35、37、42 ℃）对酿酒酵母酒精度的影响确定最佳发酵温度，依次研究不同总接种量（5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%）、初始pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5）、发酵时间（12、24、48、72、96、120、144 h）对酿酒酵母酒精度的影响。在单因素优化的基础上以醪液酒精度（Y）为评价指标，分别选取发酵温度（A）、总接种量（B）、发酵时间（C）及初始pH（D）为考察因素，根据Box-Behnken进行试验设计，将所得试验数据采用Design-Expert软件进行多元回归拟合分析，变量的编码和水平如表1 所示。其中发酵时间为接入酿酒酵母24 h后静置培养的时间，接种量为乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母的总接种量（乳酸克鲁维酵母接种量4%）。

表1 响应面试验的因素和水平设计Table 1 Factors and levels design of response surface test

1.2.5 理化指标检测 总糖、酒精度、氨基氮、总酸的检测参照《奶酒》标准GB/T 23546-2009[14]。乳糖含量的检测参照《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》标准GB/T 5412.5-2010[15]。乳糖利用率（%）=（发酵前乳糖含量-发酵液中乳糖含量）/发酵前乳糖含量×100。酵母细胞数测定采用血球计数板法[16]。浊度的检测采用分光光度法，以福尔马肼标准溶液制备标准曲线，与波长630 nm检测[17]。

牦牛乳清液及乳清酒中氨基酸、有机酸的检测采用高效液相色谱法[18]。氨基酸检测色谱柱：C18SHISEIDO（4.6 mm×250 mm×5 μm）；进样量10 μL；柱温40 ℃；紫外检测波长254 nm。有机酸的检测色谱柱：Agilent AQ（4.6 mm×250 mm×5 μm）；柱温30 ℃；进样量10 μL；紫外检测波长210 nm。

1.2.6 品评分析 根据GB/T 10220-2012《感官分析方法学总论》建立感官评分标准[19]，满分100 分；从产品色泽、风味、口感进行牦牛乳清酒的品评。挑选20 名具有一定经验的专业人士组成评定小组，进行打分，取其平均值作为总感官评分。具体评分细则见表2。

表2 牦牛乳清酒感官评分标准（分）Table 2 Yak whey wine sensory evaluation standard（score）

1.3 数据处理

所有数据均进行三次重复实验，采用SPSS17.0软件进行数据显著性分析，结果表示为平均值±标准差，标记小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，字母相同或部分相同或未标记者表示差异不显著(P>0.05)，应用Origin 7.0 软件对结果进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 乳清液的浓缩倍数

不同浓缩倍数下浓缩液中乳糖含量及浊度变化如图1 所示。从图1 中可以看出，浓缩液中乳糖含量随浓缩倍数的增加而增加，而渗析液中乳糖浓度在不同浓缩倍数下无明显减少，这说明在不同的浓缩倍数下，乳糖都没有渗透过去；不同浓缩倍数下浓缩液乳糖含量及浊度都存在显著性差异（P<0.05）；浓缩大于2 倍时，浓缩液浊度呈明显上升趋势；浓缩倍数为2 倍时，牦牛乳清中乳糖含量可达到12.3%，浊度为555 NTU。因此，选取浓缩2 倍的牦牛乳清液，静置冷却后用200 目无菌滤布过滤，冷却后备用。

图1 不同浓缩倍数下乳清中乳糖含量及浊度变化Fig.1 Lactose content and turbidity changes of whey at different concentration times

2.2 牦牛乳清酒发酵工艺条件优化

2.2.1 乳酸克鲁维酵母发酵 发酵时间对乳糖浓度及酒精度的影响结果如图2 所示。从图2 中可以看出，随着发酵时间的延长，乳糖含量降低，酒精度含量升高；发酵0 h与6 h乳糖含量无显著差异（P>0.05）；6 h后乳糖含量随发酵时间显著降低（P<0.05）；54 h后乳糖含量及酒精度与60 h无显著性差异（P>0.05）。利用乳酸克鲁维酵母发酵乳清液产生酒精，54 h后醪液中乳糖含量为0.8%，醪液酒精度为3.5%Vol，计算醪液中乳糖的利用率可达到92.7%，静置排出酵母获得上清醪液备用，确定乳酸克鲁维酵母发酵时间为54 h。

图2 发酵时间对乳糖含量及酒精度的影响Fig.2 Effects of fermentation time on lactose content and alcohol content

2.2.2 单因素实验 发酵温度、总接种量、初始pH及发酵时间对醪液酒精度的影响如图3 所示，从图3 中可以看出，15～30 ℃时，酒精度随发酵温度的升高而升高，发酵温度高于30 ℃时，酒精度呈下降趋势，分析原因为在较高发酵温度的条件下，酵母菌的生长受到限制，菌株利用糖类生产乙醇能力降低，另外高温发酵易出现菌体自溶现象，从而导致产品风味变化[20]；在低温条件下发酵虽然有利于产生丰富风味物质，但随着醪液酒精度逐渐升高，菌种的生长进程缓慢，发酵时间较长[9]。酒精度随接种量的增加而增加，接种量高于8%时，酒精度呈下降趋势。接种量过低，菌种增长缓慢，发酵时间延长；接种量过高，在主发酵阶段酵母菌生长过快、过密，会因过多地利用糖类物质生长而导致后发酵阶段各种有益风味物质积累不足，并且较高的接种量又会出现大量的酵母菌早衰而导致菌体自溶现象，影响产品的风味品质[21]。酒精度对初始pH变化较为敏感，初始pH在5.5～6.5 范围内，添加量过多或过少均会影响酒精度的大小；初始pH为6 时，酒精度最高达到13.2%Vol，较高的pH条件不利于酵母菌的生长，从而影响酵母菌产酒精能力[22]。随着发酵时间的延长，酒精度逐渐升高，发酵72 h后酒精度不再升高，影响发酵时间的因素除了发酵液中可发酵性糖含量，酵母菌株的酒精耐受力也是关键的一个因素，一般酵母菌在酒精度>15%的环境内无法生存，随着发酵过程中酒精度的升高，酵母菌的发酵性能逐渐降低也会造成发酵的结束[20]。综合考虑，选择发酵温度为30 ℃，总接种量为8%，发酵时间为72 h，初始pH为6.0。

图3 四种不同因素对酒精度的影响Fig.3 Effects of four different factors on alcohol content

2.2.3 酿酒酵母Box–Behnken响应面优化 在单因素优化的基础上以醪液酒精度（Y）为评价指标，以发酵温度（A）、总接种量（B）、发酵时间（C）及初始pH（D）为考察因素，将所得试验数据采用Design-Expert V8.0.6 软件进行多元回归拟合。Box–Behnken设计处理选项及结果如表3 所示，酒精度（Y）的二次多项回归方程为：Y=14.08+0.67A−0.43B−0.40C−0.58D+0.05AB+0.12AC+0.00AD−0.42BC+0.01BD+0.15CD−1.18A2−2.60B2−1.67C2−0.52D2。酒精度的回归模型及方差分析如表4 所示。由表4可知：模型F值为12.14，P值<0.01，表明响应面回归模型达到了极显著水平。失拟项F值3.38，P值>0.05，失拟项不显著，说明模型与试验数据之间拟合度好，可用此模型预测酒精度的情况。模型的确定系数R2=0.9239，说明该回归模型能解释92.39%响应值的变化。由回归模型和方差分析可知，方程一次项A、D，方程二次项A2、B2、C2对酒精度的影响达到极显著水平（P<0.01）；方程一次项B、C对酒精度影响达到显著水平（P<0.05），交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD、D2对酒精度的影响不显著（P>0.05）。根据F值大小可以判断出各个因素对酒精度的影响的主次顺序为：发酵温度>初始pH>总接种量>发酵时间。

表3 响应面实验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experimental

表4 酒精度的回归模型和方差分析Table 4 Regression model and variance analysis of alcohol content

各因素的交互作用对醪液酒精度影响的等高线图和响应曲面如图4 所示，能比较直观地解释各个变量和变量之间对响应值的影响。根据Design-Expert软件对建立的回归方程进行参数优化分析，可以得出在发酵温度、接种量、发酵时间、初始pH在理论上分别取31.4 ℃、7.8%、69.0 h、5.70 时，可得理论上的最大酒精度为14.4%Vol。结合实际操作条件修正发酵温度30 ℃、接种量8%、发酵时间70 h、初始pH为5.5 进行验证试验。

图4 四因素交互作用对酒精度的等高线图和响应面图Fig.4 Contour plots and response surface diagram of interaction of four factors on alcohol content

2.2.4 验证试验 在浓缩2 倍乳清液中按照4%接种量接入活化后的乳酸克鲁维酵母种子液，在30 ℃，200 r/min条件下培养54 h后静置排出酵母获得上清醪液。用0.1 mol/L NaOH溶液调整上清醪液至pH5.5，同时加入30%食品级白砂糖，接入4%活化后的酿酒酵母种子液（总接种量8%），在200 r/min、30 ℃条件下发酵24 h，检测酵母数为1.3 亿个/mL，30 ℃静置培养70 h后，检测醪液酒精度为14.1%Vol。由此可见，真实值与回归方程所预测值14.4%Vol相差不大，说明响应面优化的研究是合理可行的。将醪液采用硅藻土过滤后降温至0 ℃保藏2 d，罐装后采用巴氏灭菌法在60 ℃灭菌30 min，即可得到成品牦牛乳清酒。

2.3 牦牛乳清酒理化指标检测

检测牦牛乳清酒成品中的总糖、酒精度、氨基氮、总酸含量，如表5 所示。从表5 中可以看出，牦牛乳清酒成品酒中各项指标都符合国家成品奶酒的标准[23]。总糖的含量的多少是判断发酵是否彻底完成的主要指标，也是影响醪液酸甜度的重要因素，根据总糖含量的多少，可以将酒液分为干型、半干型、半甜型及甜型[24]。牦牛乳清酒中总糖含量为63.3 g/L，在40～70 范围内，属于半甜型奶酒。氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的总量，在各类食品中都规定了氨基酸态氮含量，氨基酸态氮含量越高，说明氨基酸含量越高，营养价值越高[21]。牦牛乳清酒中氨基酸态氮为0.09 g/L，明显高于标准中的0.05 g/L，营养价值高。总酸含量是影响酒液口感的重要因素，总酸含量过高或过低，会造成酸甜度不协调，牦牛乳清酒中总酸含量为5.2 g/L，酸度适中。牦牛乳清酒中酒精度为14.1%Vol≤18%Vol，符合发酵型奶酒酒精度的标准。牦牛乳清酒经过两段式发酵工艺，在未经过蒸馏工艺条件下，乳糖被充分利用，酒精度达到较高值。

表5 牦牛乳清酒的感官及理化指标Table 5 Sensory and physicochemical indexes of yak whey wine

2.4 牦牛乳清酒中氨基酸、有机酸的含量及品评分析

乳清蛋白含有人体必需的8 种氨基酸，且配比接近人体需求比例，被称为蛋白之王，是公认的优质蛋白补充剂之一[25−26]。乳清液经发酵后，将蛋白分解为肽类及氨基酸物质，提高了产品的营养价值，另外经酵母菌发酵，可将乳清液中乳糖转化为乙醇，增加了产品的生物活性及适口性。牦牛乳清液及乳清酒的18 种氨基酸和9 种有机酸含量如表6 所示。从表6 中可以看出，胱氨酸具有解毒促进细胞氧化还原作用，但在牦牛乳清液及乳清酒中都未检出；牦牛乳清液经过发酵，除了蛋氨酸和色氨酸没有明显的增加外，其余15 种氨基酸含量与发酵前相比都有显著性增加（P<0.05）；赖氨酸具有促进人体发育、增加免疫，提高中枢神经组织功效，牦牛乳清酒中赖氨酸含量为401.6 mg/L，与乳清液相比提高了0.5 倍；谷氨酸是身体氧化防御机制的重要物质，牦牛乳清酒中谷氨酸含量为969.6 mg/L，与乳清液相比提高了1.6倍；支链氨基酸可以促进胰岛素及生长激素的释放，牦牛乳清酒中三种支链氨基酸亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸分别为286.7、330.6、325.5 mg/L，总支链氨基酸与乳清液相比提高了0.8 倍；牦牛乳清酒与乳清液相比18 种总氨基酸含量提高了1.1 倍，8 种必需氨基酸含量提高了0.7 倍。

有机酸可以促进食欲、帮助消化，其种类和含量的多少对于产品品质和风味有着密切关系[27]。从表6 中可看出，苹果酸、马来酸及酒石酸在牦牛乳清液及乳清酒中都未检出；发酵前后乳酸含量存在显著性差异（P<0.05），而富马酸含量无显著性差异（P>0.05）；柠檬酸作为一种酸性调味剂，具有增强食欲及促进钙、磷物质的消化吸收作用；琥珀酸别名丁二酸，可产生酸味、呈味，在食品中可用于调味剂、酸度剂及防腐剂，还可以用于合成抗生素及维生素A、维生素B等[28]，在牦牛乳清酒中柠檬酸、琥珀酸含量分别为1529.3、3826.9 mg/L，而在乳清液未检出这两种有机酸，说明发酵丰富了乳清液的某些有机酸含量。

表6 乳清液及牦牛乳清酒中氨基酸和有机酸含量Table 6 Amino acid and organic acid content in whey and yak whey wine

由20 名专业人员进行牦牛乳清酒品评结果如表7 所示。从表7 可以看出，产品色泽呈均匀一致的淡黄色，平均得分为8 分；酒液组织均匀无分层，清澈透明，平均得分为9 分；酒液具有明显的发酵乳奶香味，平均得分为32 分；酒液酸甜适中，口感纯正柔和，平均得分为42 分。经过计算，牦牛乳清酒平均总得分为91 分，色泽、透明度、香气及口感都符合标准，得分较高，酒液无明显的缺陷。

表7 牦牛乳清酒的品评分析结果（分）Table 7 Evaluation and analysis of yak whey wine（score）

3 结论

牦牛奶是我国青藏高原地区独特的奶制品，以牦牛奶为原料生产制备奶酪得到的副产物牦牛乳清液与其他奶制品乳清相比营养价值更为丰富[7]。试验利用乳酸克鲁维酵母充分利用乳清中的乳糖生产酒精并产生大量有机酸性酯类物质，赋予酒体丰富的风味物质，再利用耐酒精酿酒酵母提高醪液酒精度。通过两段式乳酸克鲁维酵母发酵54 h后，醪液中乳糖含量为0.8%，利用率达到92.7%，减少了可发酵性糖添加量，降低了生产成本；采用响应面优化酿酒酵母在30 ℃、总接种量8%（乳酸克鲁维酵母4%）、发酵时间70 h、初始pH5.5 条件下，可获得酒精度为14.1%Vol的发酵型牦牛乳清酒。牦牛乳清液经发酵获得的乳清酒各项理化指标都符合国家标准，总糖含量63.3 g/L，酒精度14.1%Vol，氨基酸态氮0.09 g/L，总酸5.2 g/L，属于一种半甜型奶酒。牦牛乳清酒经过专业人员品评分析，色泽微黄、清澈透明、奶香与酒香和谐、酒体丰满，酒液无明显的缺陷，满分100 分，平均总得分为91 分。经过发酵牦牛乳清液中氨基酸及有机酸含量都有所提高；部分有益氨基酸、有机酸显含量明显提高；其中必需氨基酸、总氨基酸及有机酸含量分别提高了0.7、1.1、0.8 倍，丰富了乳清液的营养价值，具有推广应用的价值。