柱前紫外衍生—高效液相色谱法测定川贝母生物碱贝母素甲的含量

徐顺连，周加本，马维博，陈 志

(1.青海师范大学，青海 西宁 810008；2.河北工业大学，河北 石家庄 300401)

川贝母，主要是指川贝母(Fritillariaecirrhosae(CB-Fc)，暗紫贝母(Fritillariaeunibracteata(CB-Fun))和贝母(Fritillariaeprzewalskii(CB-Fp))植物的干燥球茎，是四川省地理特色的原料药材之一[1]。其干燥鳞茎具有化痰止咳、清热润肺、散结消痈的功能，主治干咳少痰、咯痰带血、阴虚劳咳等症，广泛用于中药方剂及中成药中[2]。生于海拔3 000～4 000 m山坡草丛或阴湿的小灌木丛中[3]。生物碱是川贝母的特征性成分[4]，其甾体生物碱是川贝母的主要活性成分[5]。由于川贝母中的大部分生物碱都不含生色团，当用紫外检测器进行检测时，紫外吸收很弱，所以王丽芝等人通常采用HPLC-ELSD的方法，同时检测川贝母药材中4种生物碱(贝母辛、西贝素、贝母素甲和贝母素乙)[6]。但是采用以上方法检测贝母属植物中其他生物碱时，会出现贝母素甲和贝母素乙含量都较低，未检测到西贝母碱等情况[7～9]。因此，本文主要采用柱前紫外衍生的方法对川贝母中的生物碱贝母素甲进行检测，这为川贝母中其他生物碱的检测方法提供了借鉴和参考。

1 仪器试药

岛津高效液相色谱仪(LC-20AT) 色谱柱：Agilent C18(4.6mm×150mm，5μm)，SPD-M20A 二极管阵列检测器 KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，沃特浦超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)，电子恒温水浴锅(上海赫田科学仪器有限公司)。贝母素甲对照品(纯度99% ，北京诺禾致源科技股份有限公司)，对甲苯磺酰氯(纯度98%阿拉丁科技有限公司 批号：A2010137)，甲酸(纯度为99.0%，天津市福晨化学试剂厂)，水为去离子水，甲醇、乙腈均为色谱纯。其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇—水(60∶40，V∶V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 贝母素甲标准溶液的制备 精密称取20 mg贝母素甲标准品于100 ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度线。

2.2.2 样品溶液的制备 精密称取500 mg样品，加入1 ml氨水浸润1 h，随后加入10 ml三氯甲烷：甲醇=4∶1，加热回流处理2 h；取出5 ml浓缩热干，加入500 μL甲醇复溶，待用。

2.2.3 衍生试剂的制备 精密称取400 mg的对甲苯磺酰氯于100 ml的容量瓶中，充分振荡摇匀，用乙腈定容至刻度线。

2.2.4 衍生反应的过程 取川贝母提取液1 ml于25 ml的圆底烧瓶中，加入2 ml的衍生试剂，然后在70℃的水浴锅上加热回流1 h时冷却至室温，取1.5 ml于安培瓶中，按2.1 的色谱条件测定产物的峰面积。

3 色谱条件

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 检测波长的选择 使用DAD紫外检测器对衍生剂和衍生产物分别进行扫描，在200～400 nm的范围内，衍生产物在240 nm处有最大吸收峰，而对甲苯磺酰氯在该处无吸收，故选择240 nm作为检测波长。

3.1.2 流动相的选择 以甲醇—水作为流动相，考察不同体积比的甲醇—水对衍生产物分离的影响。结果表明：随着甲醇含量的增加，保留时间缩短，当甲醇含量在60%时，峰形良好。综合考虑，选定甲醇—水(60∶40，v/v)(2/1 000的甲酸)作为流动相。

3.1.3 流速的选择 实验考察了不同流速(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml/min)对衍生产物分离的影响。随着流速的增加，保留时间缩短，峰形较好。 综合考虑分析时间、分离效率等因素，确定流速为1.00 ml/min。

3.1.4 柱温的选择 在其他色谱条件不变的情况下，实验考查了不同柱温(30℃～40℃)对衍生产物分离的影响。结果表明：随着温度的升高，贝母素甲的衍生物色谱峰的保留时间缩短，峰面积增加，但出现峰展宽。综合考虑分析时间、分离效率等因素，确定柱温为35℃。

3.2 衍生反应条件的确定

3.2.1 衍生时间 当衍生反应的温度为70℃时，分别试验时间为40、45、50、55、60、65 min对衍生产物峰面积的影响，结果发现在60 min后，衍生反应完全，故确定衍生时间为60 min，结果见图1。

图1 贝母素甲衍生产物峰面积与反应时间的关系

3.2.2 衍生温度 取贝母素甲标准溶液1 ml于圆底烧瓶中，再加入2 ml的衍生试剂，平行操作6次，分别于50、55、60、65、70、75℃的水浴锅中反应，分别反应60 min后冷却至室温，按2.1的色谱条件测定反应产物的峰面积，结果见图2，反应产物的峰面积在70℃时达到最大。

图2 贝母素甲衍生产物峰面积与反应温度的关系

3.2.3 衍生剂的用量 当衍生反应温度为70℃、衍生反应时间为60 min时，分别试验衍生剂的用量为反应物的1.4、1.6、1.8、2.0、2.2倍时，对衍生产物峰面积的影响，结果表明，峰面积在2倍时达到了最大值，结果见图3。

图3 贝母素甲衍生产物的峰面积与衍生剂用量的关系

3.3 方法性能指标

3.3.1 专属性试验 取1 ml的样品溶液于圆底烧瓶中，再加入2 ml的衍生试剂，然后按照2.2.4的操作步骤进行衍生后，用2.1的色谱条件进行测定，结果图4、5，衍生试剂对衍生产物无干扰，专属性良好。

图4 川贝母生物碱贝母素甲衍生后的HPLC

图5 衍生试剂的HPLC

3.3.2 线性关系考察 线性范围和检出限以保留时间定性，峰面积定量，贝母素甲在0.05～2.50 μg/ml范围内线性关系良好，经线性回归，得回归方程为y=2E+06x+3E+06，相关系数为R2=0.9993。

3.3.3 精密度试验 将川贝母提取液按照2.2.4的衍生条件进行衍生，按照2.1的色谱条件连续进样6次，记录峰面积，RSD=2.4%。

3.3.4 重复性试验 按照2.2.2的操作步骤制备6份提取液，按照2.2.4的衍生条件进行衍生，按照2.1的色谱条件分别进样，记录峰面积，RSD=2.7%。

3.3.5 稳定性试验 将川贝母中的贝母素甲衍生后，分别于0、2、4、8、16、24 h进行测定，记录峰面积，RSD=2.4%，表明样品在24 h内稳定。

3.3.6 加样回收率试验 在实际样品中加入不同浓度的贝母素甲标准溶液，按2.2.4进行衍生，按2.1的色谱条件进行进行测定，加标回收率结果见如下表，由表可见，加标回收率的范围在95.67%～100%。

贝母素甲的加样回收率试验

3.4 样品含量测定

取川贝母生物碱样品，按上述制备方法和衍生条件反应后，测定川贝母中贝母素甲衍生产物峰面积，根据回归方程计算贝母素甲的含量，结果表明，样品中贝母素甲的含量为3.14%。