同源组织工程生物补片在阴道重建中的实验研究

李雅倩，周逸丹，陈娜，朱兰*

临床上许多生殖道疾病包括先天性生殖道畸形、外伤肿瘤等，都会造成阴道正常解剖和功能的异常，严重影响患者身心健康。目前利用其他组织进行阴道重建手术是主要治疗方法，其中包括自体组织移植，但自体组织阴道重建有体表切口、感染、影响外观等缺点[1-3]，因此，临床急需可替代患者自体组织的修复材料。随着组织工程技术的发展，通过脱细胞技术得到的同种异体(人尸体来源)及异种(通常是猪小肠黏膜下组织或牛心包)脱细胞基质生物补片逐渐引入修复手术[4-5]。同种异体生物补片由于伦理等问题而使其来源受限，异种移植物因种属来源、组织部分等因素影响其体内的降解、并发症和治疗效果，研究报道其临床研究效果尚有争议[6-9]。本研究旨在探讨一种猪皮来源的脱细胞基质(acellular tissue matrix,ATM)补片在小型猪阴道重建中的作用，通过在小型猪阴道缺损模型中的实验研究，一方面评价该生物补片在体内的降解情况和炎症反应，另一方面评价其使阴道组织再生的能力，从而为人工阴道成形手术提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 实验动物 本研究所用实验动物为中国小型实验猪，共6只，雌性，4～6月龄，均性成熟，未孕未产，体重为(25±5)kg。由北京协和医院实验动物中心提供，单圈饲养。

1.1.2 实验材料 研究中使用的组织工程生物补片是一种国产脱细胞基质材料，来源于猪皮，通过脱细胞处理后去掉细胞成分且天然细胞外基质成分及其三维空间构象被保留；包装在无菌生理盐水中，保存在4℃。

1.1.3 主要试剂 AE1/AE3单克隆抗体，α-actin单克隆抗体，Laminin单克隆抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标二抗，组织固定液，HE染液，VG染色购自中杉金桥生物技术有限公司；其他常用化学试剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小型猪阴道缺损模型的构建和补片的植入 小型猪在麻醉状态下行阴道切除术以制备阴道缺损模型。之后，阴道外口环切，向上分离阴道“袖口”；同时将生物补片裁成合适大小，并制成一端闭合，另一端敞开的“套袖”，在补片表面间断性做6处1 cm长度的纵形切口，以利于引流。将补片塞入阴道腔穴内并保证补片和腔穴的粗糙面无间隙地紧贴，最后补片顶端缝合于子宫体段端，下端缝合于阴道前庭黏膜周围，完成阴道缺损和重建的模型。

1.2.2 HE染色观察阴道组织大体形态和炎症反应的情况 在术后1、2、4、6、8周时分别取材阴道全层并用组织固定液固定，进行石蜡包埋后切片，每片厚度约5 μm，以用于组织形态学评价。组织切片按照常规步骤进行脱蜡后分别进行苏木精和伊红染色，并于镜下进行组织形态的观察。

1.2.3 VG染色观察阴道组织胶原纤维和弹力纤维的生成情况 不同时间段的组织切片进行脱蜡后按照VG染色试剂盒的方法染色，组织经VG染色后胶原纤维呈现鲜红色，肌纤维、细胞胞质和红细胞呈现黄色，细胞核呈现黑色。

1.2.4 免疫组化染色评价上皮层和平滑肌的生长情况 不同时间段的组织切片分别进行上皮光谱角蛋白AE1/AE3抗体，层粘连蛋白Laminin抗体和平滑肌肌动蛋白α-actin抗体的免疫组织化学的染色，以表征上皮层，基质膜成分和平滑肌肌束的生成。

2 结果

2.1 大体观察及生物补片降解情况

实验动物手术后未见感染、血肿等并发症发生，不同时间段取材时均未见瘘和排斥等发生，阴道组织的生长状态良好。手术1周后可观察到阴道空穴内有补片的明显残留，补片与阴道空穴贴合较紧密，不易分离，阴道黏膜的生长不明显。2周后，阴道黏膜的生长明显可见，生物补片不完整。4周后新生黏膜较厚和完整，肉眼观察其外观与正常的阴道相似；生物补片不可见。6周后新生阴道的外观结构接近于正常的阴道黏膜，肉眼不可见未黏膜化的部位。8周后，从外观观察其与6周的新生阴道无明显差异，整个阴道黏膜的形态完整均一。结果初步提示该组织工程生物补片可促进阴道黏膜再生。详见表1。

2.2 阴道重建后上皮生成情况的评价

2.2.1 HE染色观察新生上皮细胞、新生血管情况及炎症反应情况 从HE染色结果可见，该生物补片重建阴道后，1周时没有明显看到上皮组织的存在，可观察到粒细胞和淋巴细胞。2周后阴道上皮层较薄，呈不规则的排列且疏松，可观察到淋巴细胞；4周后阴道上皮层较厚，可见多层结构的出现，多见上皮脚钉突，淋巴细胞有减少；6周后阴道上皮层较厚，可见多层结构，出现上皮极性，多见上皮脚钉突，炎症细胞较少见；8周时，新生阴道的上皮结构与正常黏膜相似，炎症细胞较少见。结果表明，该组织工程生物补片可有效生成阴道上皮层。详见下页表1和图1。

表1 生物补片植入到体内后的降解和炎症反应等情况评价

2.2.2 上皮光谱角蛋白AE1/AE3的免疫组化染色 植入补片2周后AE1/AE3的表达呈现阳性，且随着阴道重建的时间延长，阳性表达程度也相应增加。结果与HE染色的观察一致。结果表明，在植入生物补片重建阴道后上皮细胞的生成。见图2。

2.2.3 层粘连蛋白Laminin的免疫组化染色 阴道在手术重建1周后，在表皮层下的基质中可以观察到不连续棕色条带，表明Laminin染色结果阳性，提示阴道内形成了基底膜。随着阴道重建的时间延长，Laminin的阳性表达增强。层粘连蛋白属非胶原糖蛋白，主要在基底膜结构中，其在阴道重建后的基质中表达，间接反映了新生阴道中上皮层的完整性。见图3(见彩插1)。

2.3 阴道重建后平滑肌和胶原纤维生成情况的评价

2.3.1 平滑肌肌动蛋白α-actin的免疫组化染色 在阴道植入生物补片重建8周后，可观察到较完整的阴道平滑肌肌束，且肌束排列较整齐。结果表明该组织工程生物补片的植入可有效生成阴道平滑肌层。见图4。

2.3.2 VG染色 在阴道重建8周后可观察到呈现黄色染色的肌纤维以及呈现红色染色的胶原纤维，且二者的排列较整齐。与平滑肌肌动蛋白α-actin的染色结果一致。见图4(见彩插1)。

注：植入2周后，新生阴道的上皮层较薄；4周后新生阴道的上皮呈现多层结构，且上皮极向恢复，排列较为松散；6周后新生阴道的上皮呈现多层结构且上皮极向恢复，上皮呈现紧密排列；8周后新生阴道的上皮排列情况及结构与正常阴道黏膜类似。

图1组织工程生物补片重建阴道的不同时间段的HE染色，×200

注：AE1/AE3蛋白的阳性染色在植入补片第2周后出现，且随着阴道重建的时间延长，阳性表达的程度也相应增加。

3 讨论

目前临床上应用于阴道重建的方式有很多，包括最早应用的刃厚皮片移植以及来源于大阴唇、大腿内侧皮片、腹膜、肠管等部位的阴道成形术，但往往有阴道再狭窄，移植物缩短，瘢痕，润滑不足，鳞状细胞癌等并发症的发生[10-11]。最常用的乙状结肠代阴道成形术的性生活满意率很好，但由于需要腹部手术而有肠管阻塞、炎症性肠病、脱垂、二次手术等风险[12-14]。近来，研究较多的自体口腔黏膜阴道成形术有较好的阴道重建效果，但仍需进一步的临床验证[11,15]。鉴于现有阴道成形术的不足，临床上仍需研究开发新的阴道替代和重建方法。随着组织工程技术的发展，其为临床上的各种阴道缺失缺陷提供了新的治疗方法。有研究报道活检取得的阴道细胞经体外培养数周后形成上皮组织并置于阴道模具上，患者携带模具4～6周后可见阴道组织的形成，然而该方法仍需进一步研究和临床验证[16]。近年来，ATM材料在骨骼肌重塑、心肌梗塞的血管再生等的研究尤其是在皮肤损伤的临床应用，给阴道重建带来启示[17-20]。目前临床上应用的ATM材料有同种异体(人新鲜尸体)和异种(猪小肠和牛心包等)来源[21]，二者在阴道重建的作用是否有差异，目前尚不明了。既往研究表明人尸皮来源的脱细胞生物补片在小型猪阴道重建中疗效可行[21]。本研究对猪皮来源的脱细胞生物补片在小型猪阴道缺损模型中的阴道组织再生的性能进行了初步评价，结果提示同源组织工程生物补片进行阴道重建时可形成完整的阴道黏膜和平滑肌，与正常阴道结构相似，为后续临床研究提供了实验依据。

本研究使用的小型猪模型的阴道黏膜由上皮、固有层和肌层等构成，这与人阴道黏膜极为类似[22]，因此本研究选用小型猪作为实验动物具备可比性。此外，本研究采用的组织工程生物补片来源于猪皮。已有研究表明，除角质层外，猪在表皮的组织学结构、角蛋白的特征、胶原纤维的纤维束和真皮厚度等方面，与人均相似。本研究结果表明，阴道在植入补片后无明显粘连、狭窄等并发症的发生。植入生物补片2周后，大体观察可见上皮层的出现，提示该组织工程生物补片的上皮化时间较短。人工阴道重建的一个重要评价指标是能否快速诱导上皮化，本研究进一步从组织形态学染色和上皮角蛋白AE1/AE3的染色证明，植入生物补片2周后上皮细胞标志物呈阳性表达，且随着重建时间的延长，阳性表达增强，4周后上皮层的极性恢复，8周时上皮层呈现多层结构，与正常阴道黏膜相似。此外，基底膜成分可使上皮细胞的附着、迁移和分化能力增强，从而有利于补片的上皮化[18,23-25]。本研究结果显示，基质膜重要成分层粘连蛋白Laminin在补片植入2周后即呈阳性表达，随着时间的延长，阳性表达趋于均一，提示阴道重建后基底膜成分的生成，一定程度上证明了新生阴道上皮的完整性。与以往研究的人尸皮来源的生物补片相比[26]，该组织工程生物补片在阴道黏膜上皮化的速度和上皮层的形态结构再生方面达到相似结果。

正常阴道由表面的复层鳞状上皮，内环外纵排列的平滑肌层和外膜构成。研究表明，平滑肌和成纤维细胞在维持阴道结构和功能中起到重要作用。而结缔组织中大量存在的细胞外基质成分尤其是胶原纤维和弹力纤维等与阴道支持作用和组织弹性相关[27-28]。因此，利用生物补片再生的完整新生阴道组织应有平滑肌束和细胞外基质成分。为了评价再生阴道的组织结构完整性，本研究通过评价平滑肌肌动蛋白α-actin的表达表明，植入生物补片4周后可见散在的肌纤维，8周后可见较为连续的平滑肌；同时8周后胶原纤维的排列较为紧密和整齐，该组织工程生物补片在平滑肌再生方面的性能较好，与以往研究的人尸皮来源的ATM材料达到类似结果。

在临床应用时生物补片的免疫源性也是评价指标之一，以往研究报道ATM材料由于去掉细胞成分而大大降低了免疫源性，在本研究的实验过程中无明显免疫排斥反应发生，植入生物补片1周后可观察到炎症细胞，但4周后炎症细胞明显减少；表明该组织工程生物补片无明显的免疫排斥。但本研究采用的动物模型与生物补片的来源属同种，因此在研究补片免疫源性问题上有一定局限性，后续可在其他动物模型上验证并延长观察时间。

本研究构建小型猪阴道缺损和重建模型，从实验动物的围手术期和手术后的不同时间点进行结果观察以及新生阴道的大体和组织形态学评价，阐述了生物补片上皮化的时间过程，首次证明猪皮来源的组织工程生物补片在猪阴道重建术后8周即有效快速再生阴道上皮层和平滑肌层，新生阴道结构完整，可作为阴道重建的材料，为同源组织工程生物补片在临床上的应用提供实验依据。此外，本研究采用的是小型猪作为研究对象，其与临床仍有一定差距，后续工作将进一步扩大样本量和在更接近人体的动物身上验证其有效性和安全性，进而到人体进行临床实验研究。本研究不足之处在于实验动物例数偏少和缺少定量结果的评价，后续研究中需增加功能评价。