Pb胁迫下丛枝菌根真菌对樟树幼苗生长和生理的影响

王 琼，刘远杰，陈江格，李志猛，刘 玮，姜雪茹，喻苏琴

（江西农业大学 林学院/江西省森林培育重点实验室，江西 南昌 330045）

【研究意义】Pb 污染是最常见的土壤重金属污染之一[1]。城市中由于交通、工业、商业等活动导致土壤Pb 污染尤为严重[2-3]。Pb 是植物非必需元素，微量就会对植物造成毒害[4]，轻则紊乱植物的代谢过程，重则导致植物死亡[5]。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizalfungi，AMF）是土壤中的重要微生物，能与90%以上的植物形成共生关系，不仅可以改善宿主植物的生长发育，而且可以提高植物的抗重金属胁迫能力[6-8]。樟树[Cinnamomum camphor（L.）Presl]是樟科樟属常绿乔木，是我国珍贵的绿化、用材和经济树种[9]。作为城市园林中普遍应用的绿化树种，其生长环境易受Pb污染胁迫。因此，研究樟树的耐Pb能力及其与AMF 的关系具有重要意义，可为探索菌根化育苗在Pb 污染环境中的应用提供参考，同时丰富AMF在城市生态环境中应用的理论和技术。【前人研究进展】AMF可通过菌丝对重金属过滤、吸收和固持等降低重金属对植物组织造成的伤害，或者通过改善植物营养条件、调节生理状态进而促进生长，间接增强植物的重金属耐受性[10-11]。Pb 胁迫下玉米接种AMF 后，植株生物量提高，土壤中Pb 的生物有效性降低，改善了玉米的光合生理和矿质营养[12]。Pb胁迫下接种AMF提高景天三七的叶绿素含量，增强酶活性，降低丙二醛含量和体内Pb积累量，明显缓解Pb对景天三七的伤害，增强其抗逆性[13]。有关Pb胁迫对樟树生长的影响，已有研究表明低浓度Pb 对樟树幼苗没有明显伤害甚至促进生长，高浓度Pb 会导致幼苗长势衰弱，生长量下降，生长缓慢，甚至死亡[14]。可见樟树幼苗对Pb 胁迫有一定的抗性，但是当Pb 浓度较高时其生长和生理都受影响。【本研究切入点】长期生长在重金属污染土壤中的植物会逐渐产生一定的耐受性，而接种AMF 可能会进一步提高这种耐受性[15-16]。研究表明，AMF 能够促进樟树幼苗的生长，也可以缓解樟树幼苗的轻度Al 胁迫伤害[17]。但是，AMF 与樟树幼苗Pb 耐受性关系的相关研究还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究拟通过盆栽试验，探究不同Pb 浓度下接种AMF 对樟树幼苗生长和生理的影响，阐明AMF 对樟树幼苗Pb耐受性的影响及机制，为菌根化樟树幼苗在Pb污染环境中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以樟树二年生实生幼苗为研究对象进行盆栽试验。盆规格：上口径、下口径和高分别是24 cm、17 cm和13 cm。盆栽基质用园土、泥炭、河沙、珍珠岩和石英砂5 种按2∶1∶1∶1∶1 的体积比混合而成，过2 mm筛，经高温（121 ℃）高压（0.1 MPa）蒸汽灭菌0.5 h，自然冷却，备用。基础性状：全氮0.94 g/kg，有效磷7.23 mg/kg，速效钾114 mg/kg，有效Pb 1.25 mg/kg，pH为7.02。

1.2 试验方法

采用双因素随机试验设计。试验因素一为AMF 处理，分为接种与不接种处理（CK），其中接种处理的菌种为近明球囊霉（Claroideoglomus claroideum）。试验因素二为Pb 浓度处理，设置4 个梯度，分别是0（Pb0）、1（Pb1）、2（Pb2）、4 mmol/L（Pb3），以Pb（NO3）2作为Pb 源。一共8 个处理，每个处理17 株樟树幼苗，共136株。

2019 年3 月17 日进行上盆和接种处理。具体过程为：先在盆底垫上一张滤纸，每盆先统一填入1.3 kg 灭菌基质，然后接种组放入44 g接种剂，不接种组放入44 g灭菌基质，放入樟树幼苗1株，最后覆盖0.8 kg灭菌基质。栽植好后每盆统一浇纯水500 mL，放置于江西农业大学（28°45'N，115°50'E）苗圃基地温室进行正常养护。

2019 年4 月30 日进行Pb 浓度处理。按设置好的浓度配置Pb（NO3）2溶液，同时加入不等量的NH4NO3，其添加量的原则要使得所有樟树苗获得的氮素养分等量。将配好的溶液浇灌樟树盆土，每盆500 mL。Pb 处理只进行1 次。按盆土质量（2.144 kg）折算后，4 个Pb 浓度梯度分别相当于0（Pb0）、48.32（Pb1）、96.64（Pb2）、193.19 mg/kg（Pb3）。后期正常养护，其中浇水管理均采用纯水浇灌。

1.3 叶片生理指标测定

2019 年7 月16 日采集植株叶片。选择枝条中部健康无病虫害的成熟叶片，每个处理17 株中，混合采样3 份，作为3 个重复。叶片采下后立即用液氮速冻，然后保存于-80 ℃冰箱中，用于生理指标测定。测定方法：氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），高锰酸钾滴定测定过氧化氢酶（Catalase，CAT），愈创木酚氧化法测定过氧化物酶（Peroxidase，POD），硫代巴比妥酸法测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA），酸性茚三酮法测定脯氨酸（Proline，Pro），蒽酮比色法测定可溶性糖，考马斯亮蓝G-250蛋白染色法测定可溶性蛋白。

1.4 植株生长指标测定

2019年7月29日测量株高和地径。株高采用钢卷尺测定，地径采用游标卡尺测量。

2019 年8 月4 日收苗，进行根系形态和生物量测定。将樟树苗从花盆中取出，用水将根系洗净。利用EPSON Scan 根系扫描仪对根系扫描，用WinRHIZO Pro 2016a 根系图像分析软件分析根系各形态指标。将所有苗分成根、茎、叶三部分，分别装入信封，放进烘箱进行烘干处理（先在105 ℃下烘0.5 h，杀青，然后在70 ℃下烘干至恒重），称量各部分干质量，获得各器官生物量数据，3 个器官相加得全株的生物量干质量数据。

1.5 数据处理

使用Excel 2019进行数据处理和图表绘制，SPSS 26.0进行双因素方差分析和Duncan多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 Pb胁迫下接种AMF对樟树幼苗株高和地径的影响

结果表明（图1），接种AMF 和Pb 浓度处理对幼苗的株高和地径都有极显著影响，2个因素之间也存在显著的交互作用。

图1 Pb胁迫下AMF对樟树幼苗株高和地径的影响Fig.1 Effects of AMF on plant height and ground diameter of Cinnamomum camphora（L.）Presl Seedlings under Pb stress

在CK 组，不同Pb 浓度下的幼苗株高和地径无显著差异；而AMF 组，与Pb0 相比，株高在Pb3 处理显著降低，地径从Pb1 处理开始下降。与CK 组相比，在Pb0～Pb3 的梯度处理中，AMF 组幼苗的株高分别增加145%、141%、155%和96%，地径分别增加73%、61%、59%和53%（P＜0.05）。说明AMF 在0～4 mmol/L 的Pb 浓度对幼苗植株的高、粗生长都有明显的促进作用，但是高Pb 浓度下这种促进作用会减小。

2.2 Pb胁迫下接种AMF对樟树幼苗根系形态的影响

图2可知，AMF接种处理对幼苗各根系形态指标均有极显著影响，Pb浓度处理只对幼苗的根系表面积和根体积有显著影响，交互作用除根平均直径不显著外，其余根系指标均呈极显著效应。

图2 Pb胁迫下AMF对樟树幼苗根形态的影响Fig.2 Effects of AMF on root morphology of Cinnamomum camphora（L.）Presl Seedlings under Pb stress

在CK 组，幼苗的根系形态在不同Pb 浓度下变化不大，仅Pb3 浓度的总根表面积和平均根直径显著高于Pb1 处理。在AMF 组，与Pb0 相比，各浓度的Pb 处理对幼苗的根系都产生了不同程度的抑制作用，以Pb3 浓度的抑制程度最大，表现为它的4 个根系形态指标都显著小于Pb0。与株高和地径一样，相比CK 组，AMF 接种后在所有Pb 处理中都显著增大了幼苗的总根长、根表面积、根体积和平均根直径。说明AMF在0～4 mmol/L的Pb浓度都可以有效促进幼苗的根系生长。

2.3 Pb胁迫下接种AMF对樟树幼苗生物量的影响

结果表明（表1），AMF 接种处理对幼苗的茎生物量影响不显著外，各器官及全株生物量都有极显著影响，Pb处理只对叶的生物量有显著影响，交互作用除了对茎生物量不显著外，对根、叶生物量和总生物量都有显著或极显著影响。

表1 Pb胁迫下AMF对樟树幼苗生物量的影响Tab.1 Effects of AMF on biomass of Cinnamomum camphora（L.）Presl Seedlings under Pb stress

在CK 组，幼苗的各器官生物量和总生物量均未受到Pb 处理的影响。在AMF 组，与Pb0 相比，各浓度的Pb 处理均减小了根系生物量。茎、叶生物量随Pb 浓度升高呈先增大后减小的变化规律，茎生物量在Pb1 达到最大，叶生物量在Pb2 达到最大，同时它们都在Pb3 最小。从全株总生物量来看，Pb1 和Pb2处理的总生物量与Pb0没有差异，Pb3处理下总生物量显著减小。

与CK 组相比，在各个Pb 浓度处理中，AMF 组幼苗的根、茎、叶生物量和全株总生物量都显著高于CK 组，且提高幅度都比较大。就总生物量而言，在Pb0～Pb3的浓度梯度中，AMF接种后总生物量分别提高4.60 倍、4.59 倍、5.57 倍和3.65 倍，Pb2 处理提高最多，Pb3 处理提高最少。说明AMF 在4 种Pb 处理下对幼苗的生物量都有非常明显的促进作用，但是当Pb浓度较高时会抑制这种促进作用。

结合前面的株高、地径和根系形态指标，虽然在CK组中，Pb浓度处理基本未对幼苗的生长造成负面影响，但是植株的大小和生长量整体都很小，远低于AMF 组。接种AMF 在4 种Pb 处理中都能对幼苗的生长起到很大的促进作用，但是当Pb浓度达到4 mmol/L时会减小这种促进作用。

2.4 Pb胁迫下接种AMF对樟树幼苗叶片生理指标的影响

不同Pb 浓度、AMF 接种处理以及二者的交互作用均极显著影响幼苗叶片的生理指标（表2）。首先从抗氧化酶指标来看，与CK 组比，AMF 组在所有Pb 处理下均降低了SOD 活性，但是极大增强了POD 活性。CAT 活性的变化则在不同Pb 浓度下表现不同，在Pb0 和Pb2 处理中接种组的CAT 活性更大，在Pb1和Pb3处理中CK组的CAT活性更大。在CK组中，POD活性没有变化；SOD活性随着Pb浓度的梯度先降低后升高，Pb1处理最小，Pb3处理最大，显著高于Pb0；CAT活性的变化没有规律，Pb2处理与Pb0没有差异，Pb1、Pb3 处理下CAT 活性增大。在AMF 组，POD 活性在不同Pb 浓度下有差异，Pb2、Pb3 处理的POD活性高于Pb0和Pb1处理；SOD活性与CK组一样，也是以Pb1处理最小，但是Pb2、Pb3处理与Pb0相比没有差异；CAT活性随Pb浓度梯度逐渐降低，在Pb0最大，Pb3最小。可见，两组幼苗中抗氧化酶活性对Pb的响应存在很大差异。

表2 Pb胁迫下AMF对樟树幼苗生理指标的影响Tab.2 Effects of AMF on physiological parameters of Cinnamomum camphora（L.）Presl Seedlings under Pb stress

丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的最终产物，其含量的变化可反映组织的过氧化程度，间接反映细胞的受损程度，是抗性生理研究中的常用指标。AMF 组与CK 组的MDA 含量在Pb0时没有差异，但是在Pb1～Pb3处理下，AMF组的MDA含量都显著低于CK组。说明在Pb胁迫环境下，AMF帮助宿主植物减小了膜脂过氧化程度，减轻了Pb 带来的伤害。从Pb 的影响来看，与Pb0 相比，CK 组中Pb1 处理MDA 含量降低，Pb2、Pb3处理没有变化；AMF组中3种浓度的Pb处理的MDA 含量都降低。可见，两组幼苗的MDA含量都没有随Pb浓度升高而增大，说明本试验设置的Pb浓度范围内，两组幼苗都没有受到明显的Pb毒害。但是AMF组产生的MDA更少，反映出AMF的存在使得幼苗更有利于在含Pb环境中生长。

在所有Pb处理中，与CK组相比，AMF组幼苗的Pro和可溶性蛋白含量显著降低，可溶性糖含量显著增加。植物在逆境或遭受胁迫时，通常会主动积累一些物质来提高细胞液浓度，降低渗透势，提高细胞吸水或保水能力，从而适应胁迫环境。Pro、可溶性蛋白和可溶性糖都是植物体内重要的渗透调节物质，同时可溶性糖还是植物生长发育的能量物质。上述结果说明，无论在何种Pb条件下，CK 相比AMF接种而言对樟树幼苗都是更不利的生长环境，因而产生了更多的Pro 和可溶性蛋白进行渗透调节。而AMF组可能主要通过积累可溶性糖来应对Pb胁迫环境，同时可溶性糖含量的增加还为促进幼苗的生长提供能量保障。在两组幼苗中，Pro、可溶性蛋白和可溶性糖在不同Pb浓度处理的变化规律也不相同。在CK组，Pb1 处理的3 种物质的含量与Pb0 相比无差异，Pb2、Pb3 处理的可溶性蛋白含量增加，可溶性糖含量减少，Pb3 处理的Pro 含量也减少。AMF 组中，与Pb0 相比，3 种含Pb 处理下可溶性蛋白无显著变化，而Pro含量都显著增加。说明AMF影响了幼苗应对Pb胁迫的渗透调节策略。

3 讨论

3.1 不同Pb浓度下AMF对樟树幼苗生长的影响

Pb 胁迫下的玉米[18]、小麦[19]等研究均发现接种AMF 可以缓解Pb 胁迫对宿主植物生长造成的伤害。与这些研究结果一致，本研究发现在不同Pb浓度处理中，接种AMF均显著增大樟树幼苗的株高和地径，促进根系发育，提高生物量，明显促进樟树幼苗生长。一般认为，AMF 能够通过影响植物对重金属的吸收、转运和积累，加强植物对土壤中水分、养分的吸收，影响植物的生理生化代谢等方面，来促进植物生长，提高宿主植物对重金属的耐性[20-21]。

有关Pb胁迫对植物生长的影响，前人已有许多研究。马英超[22]发现构树幼苗在低Pb浓度（150 mg/kg）下生长良好，起促进作用；而中高Pb 浓度（450～1 500 mg/kg）胁迫对构树幼苗的生长造成伤害，起抑制作用。赵英鹏[13]指出当Pb 浓度为250 mg/kg 时景天三七的根长和茎粗未受Pb 处理影响，但随着Pb 浓度增加，其根长和茎粗显著减少，在1 000 mg/kg时达到最低。本试验的结果表明，AMF组幼苗在最高Pb浓度（4 mmol/L）下与Pb0相比生长受到一定抑制，CK组幼苗的生长在4种不同Pb浓度之间没有明显的差异，但是整体长势比AMF 组差很多（从生长数据可知）。CK 组幼苗的生长没有受到明显的Pb 胁迫影响，一方面是由于本研究中所设置的Pb浓度不高，而樟树本身对Pb有一定的耐性[14]。另一方面在试验中观察到CK 组幼苗植株矮小，叶片偏黄，长势较弱，因而推测其根系吸收能力较差，导致对土壤中的Pb吸收不多。而AMF 组幼苗相对长势旺盛，根系吸收能力强，并且AMF 的菌丝对土壤Pb 也会有一定的吸收，因而可能有更多的Pb进入幼苗体内，致使高浓度下生长受到抑制。黄丽[23]在关于AMF对刺槐耐Pb能力的研究结果中也表明，接种刺槐的根部总Pb含量明显高于不接种处理。本试验中接种的樟树幼苗在高浓度（4 mmol/L）下生长受限的具体原因还有待于进一步探索。

3.2 不同Pb浓度下AMF对樟树幼苗生理的影响

在重金属胁迫环境中，影响植物生长发育的主要原因之一是植物体内产生了大量的活性氧集团，使细胞膜系统受到伤害，甚至导致细胞死亡[24]。同时植物会通过激活抗氧化酶和增加Pro等渗透调节物质来消除活性氧，防止细胞膜质过氧化，减轻细胞伤害。SOD、POD 和CAT是植物体内最主要的抗氧化酶，它们在防御生物体氧化损伤方面起到重要作用[25]。有关Pb胁迫下AMF 对宿主植物抗氧化酶的影响，大部分研究认为接种AMF 后植物的抗氧化酶活性提高。谭灵杰等[26]发现Pb 污染环境下接种AMF 的美洲黑杨叶片的POD 和SOD 活性均提高。赵英鹏[13]也发现，Pb胁迫下接种AMF 后，景天三七的SOD、POD 与CAT 活性提高，降低了自由基的产生速度，对景天三七起到了一定的保护作用。而本研究结果表明，在所有Pb 处理中，AMF 接种后樟树幼苗叶片的SOD 活性显著降低，POD 活性极大提高，CAT 活性因Pb 浓度而异。可见，不同共生体系（宿主植物与AMF）以及Pb浓度的不同都会导致抗氧化酶系统的应激响应不同。POD活性增强是本试验中AMF对Pb环境下生长的樟树幼苗的重要生理调节之一。

MDA是反映植物遭受逆境伤害程度的重要指标[7]。与一些研究[19,27]的结果不太一致，本研究发现CK组和AMF 组幼苗的MDA 含量都没有随Pb 浓度升高而增大。这主要与本试验设置的Pb 浓度不高有关。在低Pb 浓度下，MDA 含量甚至低于Pb0 处理，这可能是植物在Pb 胁迫下的一种自我保护能力，与赵英鹏[13]在景天三七上的研究结果类似。但是，与CK 组相比，AMF 接种处理在3 种Pb 浓度下都显著降低了MDA 含量，表明AMF可以减缓樟树幼苗叶片中的细胞膜氧化，减轻Pb带来的伤害。MDA 含量减少也是AMF对樟树幼苗耐Pb能力提升的关键调节指标之一。

Pro是一种有效的渗透调节物质。逆境胁迫下，Pro含量会增加，用以维持细胞膨压、减轻渗透胁迫，增加蛋白可溶性，还可以清除过多的自由基[28]。与牛振川[29]在玉米上的研究结果一致，在所有Pb 处理下，AMF 接种组的Pro 含量都低于未接种组（CK），说明接种AMF 后降低了Pb 对樟树幼苗生理毒害中产生的游离Pro含量，CK组幼苗为了应对Pb胁迫必须产生更多的Pro。可溶性蛋白也是重要的渗透调节物质，同时又是营养物质。与Pro一样，AMF接种组的可溶性蛋白含量也低于CK组。这一方面同样是因为接种条件下植物受到的胁迫更轻，从而不需要过多的渗透调节物质；也有可能是樟树幼苗在与AMF的共生过程中消耗掉了一些可溶性的养分[30]。有研究指出，植物内的蛋白成分可能会参与合成AMF 分泌到土壤中的球囊霉素蛋白[31-32]，这也可能是本试验中接种组幼苗Pro 和可溶性蛋白降解的原因之一。可溶性糖也是渗透调节物质。与Pro 和可溶性蛋白的变化不一样，接种组的可溶性糖含量显著高于CK 组。说明接种组幼苗主要通过积累可溶性糖来应对Pb 胁迫环境，也为生长发育提供充足的能量，从而促进生长，提高了生物量。

4 结论

在0～4 mmol/L 的Pb浓度，接种AMF 均显著促进樟树幼苗的生长，但4 mmol/L Pb 浓度下促进作用减小。接种AMF也显著影响樟树幼苗的生理指标。在各Pb浓度中，AMF组SOD活性、Pro和可溶性蛋白含量降低，MDA 含量减少（Pb0除外），POD 活性和可溶性糖含量增加。因此，POD 活性增强、可溶性糖积累以及MDA 含量减少是AMF 在Pb 胁迫下促进樟树幼苗生长的生理调节机制。在类似的土壤Pb 环境中，可通过接种AMF来促进樟树幼苗生长，提高其耐Pb能力。