三疣梭子蟹可食组织对无机砷的富集和释放

赵艳芳，宁劲松，康绪明，丁海燕，翟毓秀，尚德荣，盛晓风

( 中国水产科学研究院 黄海水产研究所，农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，山东 青岛 266071 )

砷是世界范围内危害最大的环境污染物之一，2017年被美国有毒物质与疾病登记署和环境保护署列为“优先污染物列表”的首位[1]。自然界中不同来源的砷元素通过陆地径流、废水排放等途径进入海洋生态系统，砷污染已成为我国近海区域严重的环境问题之一[2]。有研究表明，砷在许多海洋食物链(网)中被生物放大，能造成高营养级生物中砷的富集，可对生物与人类健康产生潜在危害[3]。海洋生物普遍具有较高的砷累积，导致海产品摄入成为人体暴露砷元素的主要途径之一。研究表明,人们日常饮食中约90%的砷来自于海产品[4]。

砷在海水和沉积物中主要以无机砷形式存在，转移到生物体内的砷可能会转变为各种价态的砷化合物。研究表明，无机砷形式的三价无机砷[As(Ⅲ)]和五价无机砷[As(Ⅴ)]具有较高的毒性和致癌性，有机砷包括低毒的一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)，微毒的砷糖(AsS)、砷甜菜碱(AsB)等[3-4]。海洋生物对砷的富集及形态转化规律的研究表明，不同海洋生物对无机砷的富集能力不同，如贻贝对无机砷富集能力较弱，而牡蛎对无机砷有较强的富集和转化能力[5]，菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)对三价砷的生物利用度高于五价砷，且砷更易于在肝胰腺中积累，无机砷在菲律宾蛤仔鳃组织中主要转化为二甲基砷酸，肝胰腺中主要转化为砷甜菜碱[6-7]。

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国海水养殖和增殖的重要经济蟹类[8-10]，因其味道鲜美且营养价值高，深受消费者喜爱。同时作为一种营养级别较高的甲壳类海产生物，海蟹类对砷元素具有较强的富集能力[11]。水相暴露和食物相暴露是海洋生物累积痕量元素的主要途径[12]。研究证明，通过食物相暴露的砷主要是有机砷，而无机砷很少，因为砷在海洋生物体内主要以砷甜菜碱形态存在，使得砷甜菜碱成为通过食物链传递和储存的砷的最终形态[13-15]。而海水中的砷元素主要以无机砷形态存在，因此研究生物体对水相中无机砷的富集转化规律对于揭示砷的毒性和健康风险具有重要意义。笔者研究海水中不同质量浓度的三价无机砷和五价无机砷在三疣梭子蟹3种可食组织中的富集与转化情况，旨在阐明三疣梭子蟹对不同价态无机砷的积累和转化规律，同时为三疣梭子蟹安全养殖和食用安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

成熟雌性三疣梭子蟹于2018年10月购自青岛市西海岸新区蟹类养殖场，养殖用海水中无机砷本底值为(1.11±0.21) μg/L。选取健康、活力强、规格基本一致的三疣梭子蟹[全甲宽(140.02±15.14) mm]于实验室暂养96 h，暂养结束后随机分组用于试验。暂养和正式试验期间，保持室温和自然光照，海水平均温度(16.5±1.7) ℃，pH 8.1±0.02，24 h持续充氧。

1.2 试验方法

试验在5个500 L的聚乙烯水族箱中进行，养殖水体300 L，各放入30只经暂养净化的成熟雌性三疣梭子蟹。称取适量的砷酸钠和三氧化二砷固体，溶解稀释后分别配成10 mg/mL的三价无机砷和五价无机砷储备液。根据养殖用海水中无机砷的含量，并参考文献[6]，设定三价无机砷和五价无机砷的暴露质量浓度分别为0.01 mg/L和0.10 mg/L，共4个暴露组。对照组为干净过滤的新鲜海水，不添加无机砷，且对照海水中无机砷本底值为(1.18±0.16) μg/L。暴露时间为7 d，采用半静态试验方法，每隔24 h完全换水1次，并分别添加准确质量浓度的三价和五价无机砷含量，分别于暴露的第1、3、5、7天随机取梭子蟹3只，立即解剖分离出肝胰腺、性腺和肌肉3种可食组织，保存于-80 ℃超低温冰箱备用。释放试验为28 d，将各试验箱中换成300 L自然海水，每隔24 h完全换水1次，分别于释放阶段的第7、14、21、28天随机取梭子蟹3只，立即解剖分离出3种可食组织，并低温保存备用。整个试验期间，各处理组的三疣梭子蟹均无死亡现象发生。

1.3 砷形态分析

取均质后的梭子蟹3种可食组织约1.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，涡旋混匀后，超声提取40 min，4 ℃，8000 r/min离心10 min后，吸取上清液过0.45 μm滤膜，滤液注入高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱联用仪(HPLC-ICP-MS)对砷甜菜碱、三价无机砷、五价无机砷、一甲基砷酸和二甲基砷酸5种形态的砷进行定性和定量分析。

高效液相色谱HPLC(Series 200，Perkin-Elmer)，分离条件：阴离子保护柱IonPac AG 19 (50 mm×4 mm)，阴离子分析柱IonPac AS 19(250 mm×4 mm)；流动相，A相组成(10 mmol/L无水乙酸钠，3 mmol/L硝酸钾，2 mmol/L磷酸二氢钠，0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH 10.7)，B相组成(无水乙醇)，V(A)∶V(B)=99∶1；流速1.0 mL/min；进样量30 μL。仪器自动积分，以峰面积计算所含各形态砷的量。三价无机砷的方法检出限为0.002 mg/kg，五价无机砷的方法检出限为0.004 mg/kg。电感耦合等离子体质谱ICP-MS(DRC Ⅱ，Perkin-Elmer)，工作参数：射频功率1150 W，等离子体气流速15 L/min，辅助气流速1.2 L/min。

1.4 总砷含量分析

准确称取三疣梭子蟹3种可食组织1.0 g于聚四氟乙烯微波消解罐中，每个样品中加入8.0 mL浓硝酸(优级纯)，摇匀后加盖放置过夜，将样品进行预消解后，将样品放入微波消解系统中，设置适宜的微波消解程序，进行消解。消解完毕后，赶酸至1～2 mL，冷却至室温后用超纯水定容至50 mL，ICP-MS上机测定。微波消解和赶酸程序见表1。同时做试剂空白试验，采用扇贝粉(GBW10024)作为质控样进行结果质量控制，对质控样品总砷含量的5次测定结果表明，测定值为(3.52±0.23) mg/kg，在标准值3.0～4.2 mg/kg内，说明该测定方法的准确度高。

表1 微波消解程序

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 16.0统计分析软件对不同组织对砷的富集能力进行比较分析，对不同组织中砷的含量在暴露与释放过程中的变化进行单因子方差分析，采用Sigma plot 12.5作图，Excel软件进行测定数据平均值与标准偏差的分析处理，试验数据为3次测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 三疣梭子蟹可食组织中总砷含量变化

受三价和五价无机砷暴露后，三疣梭子蟹可食组织中总砷的含量随着暴露剂量的升高和暴露时间延长以及在释放过程中的变化见图1、图2。为比较不同组织对砷的富集能力，对不同组织富集三价和五价无机砷过程中的总砷含量进行t检验，分析发现，肌肉组织对砷的富集能力均显著低于性腺和肝胰腺，而性腺和肝胰腺对砷的富集能力之间无显著差异。

图1 三价无机砷富集与释放过程中三疣梭子蟹可食组织中总砷含量Fig.1 Total As content in the edible tissues of swimming crab P. trituberculatus during As (Ⅲ) accumulation and releaseA.富集； E.释放； 不同字母表示相同处理组砷含量随不同暴露/释放时间变化呈显著性差异(P<0.05)；下同.A.accumulation; E.release; means with different letters are significant differences with the changes in exposure/release periods (P<0.05); et sequentia.

图2 五价无机砷富集与释放过程中三疣梭子蟹可食组织中总砷含量Fig.2 Total As content in the edible tissues of swimming crab P. trituberculatus during As (Ⅴ) accumulation and release

在对三价无机砷的富集与释放的过程中，不同组织中总砷含量的变化不同。对于肌肉组织，总砷含量随三价无机砷质量浓度的升高和试验时间的延长没有显著的变化规律。对于性腺组织，在富集试验期间，总砷含量的升高趋势不明显，但高质量浓度暴露组中总砷含量高于低质量浓度暴露组。在释放试验期间，0.01 mg/L和0.10 mg/L三价无机砷处理组性腺组织中的总砷含量呈显著下降趋势。对于肝胰腺组织，高质量浓度暴露组中总砷含量高于低质量浓度暴露组，另外在暴露试验和释放试验初期，高质量浓度暴露组中总砷含量均呈现先显著升高后逐渐下降趋势，低质量浓度暴露组的总砷含量在暴露期间无明显变化规律，但在释放试验过程中的变化规律与高质量浓度暴露组相同。释放28 d后，2种暴露质量浓度组性腺与肝胰腺组织中的砷含量均显著低于空白对照组(P<0.05)。

三疣梭子蟹3种可食组织对五价无机砷的富集能力较弱，在富集与释放过程中，肌肉组织中总砷含量无明显的变化规律(图2)。对于性腺组织，在富集过程中总砷含量变化规律不明显，但在释放28 d后，含量均下降。对于肝胰腺组织，总砷含量在暴露试验期间也呈现出先显著升高后下降的趋势，且在释放试验过程中呈不断下降的趋势。同三价无机砷处理组相同，至释放试验结束后，性腺和肝胰腺组织中总砷含量下降至显著低于对照组水平(P<0.05)。

2.2 三疣梭子蟹可食组织中砷形态变化

2.2.1 三价无机砷暴露

空白对照组三疣梭子蟹肌肉、性腺及肝胰腺3种组织中砷的主要赋存形态见图3，三疣梭子蟹3种可食组织中砷的主要存在形态略有不同，主要表现在肌肉与性腺组织中砷主要以砷甜菜碱和二甲基砷酸形态存在，肝胰腺组织中主要以砷甜菜碱形态存在。

暴露于0.01 mg/L三价无机砷水环境中，3种可食组织中砷的赋存形态与对照组相同，其中肌肉组织中砷甜菜碱的含量低于性腺和肝胰腺组织，而不同组织之间二甲基砷酸含量无明显区别，且各组织中的砷甜菜碱和二甲基砷酸含量在富集三价无机砷的过程中没有明显的变化规律(表2)。暴露在0.10 mg/L三价无机砷环境中，三疣梭子蟹可食组织中砷的存在形态发生变化。在富集的第1、3、5、7天中，肝胰腺组织中均检测到低质量浓度的三价无机砷(0.03～0.07 mg/kg)，且砷甜菜碱是主要存在形态，未检测到二甲基砷酸；肌肉组织中砷主要以砷甜菜碱和二甲基砷酸形态存在，未检测到无机砷；性腺组织中砷主要以砷甜菜碱和二甲基砷酸形态存在，在富集的第7天，检测到低质量浓度的三价无机砷。

图3 三疣梭子蟹3种可食组织中砷形态谱图Fig.3 Type analysis of As in three edible tissues of swimming crab P. trituberculatus

表2 三价无机砷暴露和释放过程中三疣梭子蟹不同可食组织中不同砷形态含量 mg/kg

释放过程中，低质量浓度暴露组中三疣梭子蟹3种可食组织中砷的主要形态于暴露期间无变化，且各形态砷含量无显著变化。高质量浓度暴露组中肝胰腺组织在排出砷的7、14、21 d后均检测到三价无机砷，含量为0.03～0.04 mg/kg，排出试验28 d后，三价无机砷未检出。而肌肉与性腺组织中，砷的主要形态仍以砷甜菜碱和二甲基砷酸为主。

2.2.2 五价无机砷暴露

0.01 mg/L五价无机砷富集和释放过程中，三疣梭子蟹3种可食组织中砷的主要赋存形态与低质量浓度三价无机砷处理组相同，即肌肉与性腺组织中的砷主要以砷甜菜碱和二甲基砷酸形态存在，肝胰腺组织中主要以砷甜菜碱形态存在(表3)。

由表3可见，对高质量浓度五价无机砷(0.10 mg/L)富集过程中，第1天，在肝胰腺组织中AsB是主要砷形态，此外还检测到0.03 mg/kg三价无机砷和0.04 mg/kg五价无机砷，而在肌肉与性腺组织中未有无机砷积累。第3天时，肝胰腺组织中有砷甜菜碱和0.02 mg/kg三价无机砷检出，肌肉与性腺组织中均未有无机砷积累。余下的富集和释放试验中，3种可食组织中均未检出无机砷，并且肌肉与性腺组织中砷的主要赋存形态及其含量变化规律与三价无机砷处理组相同。

表3 五价无机砷暴露和释放过程中三疣梭子蟹不同可食组织中不同砷形态含量 mg/kg

3 讨 论

3.1 三疣梭子蟹可食组织对无机砷的富集代谢

海洋动物富集的砷含量普遍较高，如多毛类和腹足类等底栖生物[16]。严国等[11]对包括青蟹(Scyllaserrata)、三疣梭子蟹、日本蟳(Charybdisjaponica)和细点圆趾蟹(Ovalipespunctatus)等158个海蟹类样品中总砷含量分析发现，海蟹类是砷高富集产品，总砷含量达0.37～35.81 mg/kg。本试验也发现，未经暴露三疣梭子蟹肌肉、性腺和肝胰腺组织中总砷含量分别为2.19，4.00、3.32 mg/kg。海蟹对金属元素的富集要包括两种途径，一是通过鳃富集水相中的金属离子，二是通过摄食途径。已有试验表明，许多海洋生物对海水中无机砷的富集能力较低，如紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)暴露在100 μg/L 的三价和五价无机砷10 d后，组织中总砷含量没有显著变化[17]。褐虾(Crangoncrangon)在100 μg/L 的五价无机砷暴露24 d后组织中总砷含量与对照组无显著变化[18]。花身(Teraponjarbua)幼鱼在100 μg/L 三价和五价无机砷暴露10 d后体内积累的总砷含量也很少[19]。对菲律宾蛤仔进行30 d 无机砷暴露后发现，鳃部累积的砷显著高于消化腺，蛤体内砷的主要形态为砷甜菜碱和二甲基砷酸[6-7]。无机砷在栉孔扇贝(Chlamysfarreri)体内的富集系数较小[20]，紫贻贝在质量浓度100 μg/L的砷暴露下，生物富集系数为15.41，远低于对汞、铅、镉等元素的富集能力[21]。牡蛎对砷的富集能力也远低于汞、镉、铅等元素[22]。本试验也表明，0.01和0.10 mg/L无机砷暴露7 d，与对照组相比，三疣梭子蟹肌肉组织中总砷含量变化未达到显著性差异。且肌肉组织对砷的富集低于性腺和肝胰腺组织，而性腺和肝胰腺组织之间对砷的富集无显著差异。释放试验28 d后，性腺和肝胰腺组织中总砷的含量显著下降，说明这2种可食组织对砷的代谢能力较强。试验同时发现在富集无机砷的过程中，尤其是高质量浓度暴露组，肝胰腺组织中总砷含量呈现先升后降的变化趋势，这种现象可能是三疣梭子蟹对无机砷暴露的一种抵御机制。生物体吸收富集有害元素的过程中，有害元素在各组织之间会重新分配或转移[12]，因此在三疣梭子蟹富集无机砷的过程中，各组织之间的砷可能会重新分配，肝胰腺组织中的砷转移到鳃、血淋巴液等其他组织中，从而呈现先升后降的趋势。

3.2 三疣梭子蟹可食组织中砷的形态转化

海洋生物普遍具有将从环境中吸收的无机砷通过生物转化合成砷甜菜碱的能力，这种生物转化过程包括五价无机砷还原为三价无机砷，三价无机砷甲基化至一甲基砷酸和二甲基砷酸，以及经过后续未知的过程合成砷甜菜碱[13-15]。在菲律宾蛤仔体内不仅存在无机砷的还原甲基化过程，而且还存在三价无机砷氧化为五价无机砷的情况[6]。Zhang 等[5]发现僧帽牡蛎(Saccostreacucullata)在1 mg/L 三价无机砷暴露30 d后，组织中五价无机砷含量增加20倍。而在三疣梭子蟹组织中，三价和五价无机砷暴露处理后，肌肉、性腺和肝胰腺组织中砷的主要存在形式为砷甜菜碱和二甲基砷，无机砷非常少，主要以三价无机砷形式存在，说明存在砷酸盐的还原，并不存在三价无机砷氧化为五价无机砷的情况。生物体将三价无机砷氧化为五价无机砷储存在体内可能是动物的一种解毒方式，将过多的三价无机砷转化成毒性较低的五价无机砷贮存或隔离[6]。本试验现象也可能说明，三疣梭子蟹对无机砷的耐性较高，或是本试验设定的无机砷质量浓度尚不能对三疣梭子蟹的3种可食组织产生毒性。

另外本试验结果表明，暴露于相同质量浓度的三价和五价无机砷，三疣梭子蟹肝胰腺组织对三价无机砷的积累能力较高，从暴露试验第1天开始，至释放试验21 d后，均能检出三价无机砷(表2)，而对于五价无机砷的积累能力较低，仅在暴露试验1 d后，肝胰腺组织中检出三价无机砷和五价无机砷，而在暴露试验3 d后，仅能检出三价无机砷(表3)。因此，三疣梭子蟹对三价无机砷的吸收利用高于五价无机砷，同样的结果出现在菲律宾蛤仔[6]、僧帽牡蛎[5]的相关研究中，表明三价砷比五价砷可能更易于被生物体吸收代谢。

由于砷甜菜碱结构类似甜菜碱，其半致死质量浓度大于10 000 mg/kg，被视为无毒的有机砷形态[23]，因此海洋生物体内砷甜菜碱的合成，也是生物体的一项重要解毒机制[24]。本试验结果表明，三疣梭子蟹肝胰腺组织中的砷主要以砷甜菜碱形态存在，并且在三价无机砷高质量浓度暴露与释放期间，体内积累的三价无机砷主要储存在肝胰腺组织，而肌肉与性腺组织中的砷以砷甜菜碱和二甲基砷酸两种形态存在，且几乎不富集无机砷。试验结果同时表明，在释放试验后期，肝胰腺组织中检测到少量的砷的二甲基化产物，说明肝胰腺组织是梭子蟹无机砷甲基化的主要场所。肝胰腺也是菲律宾蛤仔无机砷转化为砷甜菜碱的主要组织，这可能与参与无机砷转化相关的蛋白在肝组织中表达量更高有关，还需要进一步试验验证。

海水蟹作为砷高富集品种[9]，但有关其高富集砷的特性机制及其主要的富集代谢途径尚不清楚。本研究的富集代谢试验表明，三疣梭子蟹对水相中三价无机砷的富集能力高于五价无机砷，而海水中五价无机砷是最主要的砷形态，其三价无机砷约占五价无机砷含量的13%[23]，因此，三疣梭子蟹虽然作为砷元素高富集生物，但是通过水相富集无机砷的作用较小。研究表明，砷在海洋食物链中能够被生物放大，造成高营养级生物中的砷富集，并且有机砷比无机砷具有更高的食物链传递能力，可能导致海洋生物富集更高含量的砷[3]。因此，亟需开展三疣梭子蟹通过食物相对砷的富集和传递研究，探讨砷的不同形态在食物链传递过程中的变化规律及其对砷生物富集放大的影响机制，以揭示三疣梭子蟹高富集砷的特性机制。

4 结 论

三疣梭子蟹肌肉组织对三价和五价无机砷的富集能力显著低于性腺和肝胰腺，而性腺和肝胰腺两种组织之间无显著差异。三疣梭子蟹可食组织对三价无机砷的生物利用度高于五价无机砷，无机砷主要积累在肝胰腺组织中，而肌肉与性腺组织中无无机砷累积。肝胰腺组织中的砷主要以砷甜菜碱形态存在，而肌肉与性腺组织中的砷以砷甜菜碱和二甲基砷酸两种形态存在。