药用聚异戊二烯橡胶细胞毒性的研究

刘海洪，崔 喆，2，付 鹏，2*

（1.郑州大学 材料科学与工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省先进尼龙材料及应用重点实验室，河南 郑州 450001）

聚异戊二烯橡胶具有顺式-1，4-结构含量和相对分子质量大、凝胶含量小、纯净、无杂质、透明、有光泽等优点，在医药包装材料和医疗器械配件，如注射液用胶塞、真空采血器胶塞、橡胶垫片、预灌封注射器用橡胶针头护帽和输液器用橡胶肝素帽等中大量应用[1-5]。

市场上流通的药用聚异戊二烯橡胶生产时所用的催化剂主要有齐格勒型催化剂、烷基锂型催化剂和稀土化合物催化剂等。目前比较典型的药用聚异戊二烯橡胶是美国科腾聚合物有限公司采用烷基锂型催化剂生产的IR0307和广东茂名石化有限公司采用齐格勒型催化剂生产的IR80[6-9]。

聚异戊二烯橡胶是异戊二烯单体经过聚合反应而制得的，生产过程中除需要添加催化剂外，还需要添加溶剂、防老剂和稳定剂等，将这些添加剂的含量控制在一定限度范围内，对保证聚异戊二烯橡胶的化学安全性和生物安全性很关键。

国内外相关法规对于医用基础橡胶材料的生物安全性，如原材料的细胞毒性、过敏性、刺激性、全身毒性和遗传毒性等越来越重视[10-11]。本工作主要对药用聚异戊二烯橡胶生物安全性指标中的细胞毒性进行研究。细胞毒性的检测，是将一定量的供试品溶液加入细胞培养液中，培养细胞，通过对细胞形态增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞潜在毒性的作用[12]。

在GB/T 14233.2—2005《医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法》中，细胞毒性试验主要是针对医疗器械浸提液[浸提介质是质量分数为0.9%的氯化钠（NaCl）注射液]，采用四唑盐比色法和显微镜观察法进行；在GB/T 16886.5—2017《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》中，在细胞毒性试验的试样制备过程中，对于浸提介质的选择要先进行验证，当浸提过程中使用含血清培养基时，只能采用（37±2）℃下不短于24 h的浸提条件。

本工作选择IR0307和IR80为研究对象，采用不同浸提介质和浸提处理方法，研究对比两种橡胶样品的细胞毒性，探讨影响聚异戊二烯橡胶细胞毒性的因素，从而为药用聚异戊二烯橡胶的生产提供参考。

1 实验

1.1 主要原料和试剂

IR0307，美国科腾聚合物有限公司产品；IR80，广东茂名石化有限公司产品；质量分数为0.9%的NaCl注射液（简称0.9%NaCl注射液）和纯化水，市售品。

1.2 主要仪器

二氧化碳培养箱、倒置显微镜、酶标仪、振荡器、分度值为0.001 g的电子天平、定时器、移液器和96孔培养板等。

1.3 试样制备

1.3.1 供试品及对照品制备

供试液：取洁净的供试品（橡胶材料），必要时用适宜的清洁剂清除油污，再用纯化水冲洗干净，用滤纸吸干后切成0.5 cm×2 cm的长条，置于玻璃容器内，加浸提液（按照0.2 g供试品加1 mL浸提液的比例），使浸提液浸没供试品。

供试品浸提条件及处理方法分为两种：（a）将放置供试品的容器置于高压灭菌器内，在121 ℃下浸提60 min，冷却至室温，用该浸提液作为溶剂配制MEM（Minimum Essential Medium）培养基，添加质量分数为10%的牛血清后用于试验；（b）供试品于密闭容器内在37 ℃下浸提24 h，冷却至室温，用该浸提液作为溶剂配制MEM培养基，添加质量分数为10%的牛血清后用于试验。

阴性对照品：按3 cm2对照品加1 mL浸提液的比例添加浸提介质，浸提液制备方法同供试品。

阳性对照品：体积分数为10%的二甲基亚砜的完全培养基。

空白对照品：采用新鲜细胞培养液进行试验。

1.3.2 细胞悬浮液制备

对已培养48～72 h、生长旺盛的L-929细胞消化2～3 min，加入MEM培养液，混匀并计数，配制成每毫升10 000个细胞的细胞悬浮液，备用。

1.4 测试分析

1.4.1 显微镜观察法

将配制好的细胞悬浮液接种于96孔培养板内，每孔加入100 μL细胞悬浮液，按照GB/T 14233.2—2005中显微镜观察法的试验要求，培养48 h后置于显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 四唑盐比色法

四唑盐比色法的原理是活细胞的线粒体酶可将黄绿色的四唑盐降解生成蓝紫色物质，用二甲基亚砜将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例[13]。试验过程是测定供试品浸提液与L-929细胞直接接触产生的细胞毒性，以细胞相对增殖率（RGR）进行分级[14-15]。

本工作采用四唑盐比色法结合显微镜观察法测定橡胶体外细胞毒性。按照1.4.1节的步骤制备供试品，培养48 h后置于显微镜下观察细胞形态；然后每孔加入20 μL四唑盐比色法溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150 μL二甲基亚砜，在振荡器上振荡10 min，在酶标仪上以570 nm为测量波长、630 nm为参考波长测定吸光度，计算试样的细胞RGR：

式中，R为细胞RGR，A为供试品或阴性、阳性对照品的吸光度，A0为空白对照品的吸光度。

1.4.3 细胞毒性反应分级

在GB/T 14233.2—2005细胞毒性试验中，在显微镜下观察分析细胞形态；在四唑盐比色法试验中，根据细胞RGR，细胞毒性反应被判定为0，1，2，3和4五个等级（见表1）。阴性对照品的细胞毒性反应等级应不大于1，阳性对照品的细胞毒性反应等级至少为3，才表明试验成立。供试品的细胞毒性反应等级应不大于2才合格。

表1 细胞毒性反应分级Tab.1 Cytotoxicity reaction grade

2 结果与讨论

2.1 以0.9%NaCl注射液为浸提介质的试验分析

2.1.1 显微镜观察法

以0.9%NaCl注射液作为浸提介质，分别采用121 ℃×60 min和37 ℃×24 h两种浸提条件处理供试品，通过显微镜观察细胞形态，结果如表2所示。

表2 两种浸提条件下的细胞形态显微镜观察结果Tab.2 Cell morphology observation by microscope under two extraction conditions

2.1.2 四唑盐比色法

以0.9%NaCl注射液作为浸提介质处理供试品，显微镜观察的细胞形态如图1所示，四唑盐比色法测定的细胞毒性见表3。

图1 0.9%NaCl注射液浸提条件下显微镜观察的细胞形态（放大40倍）Fig.1 Cell morphology observed by microscope under 0.9%NaCl injection extraction conditions（magnified by 40 times）

由表3可知：以0.9%NaCl注射液作为浸提介质，在121 ℃×60 min浸提条件下，IR0307和IR80的细胞毒性反应等级均为2；在37 ℃×24 h浸提条件下，IR0307和IR80的细胞毒性反应等级均为1。

表3 0.9%NaCl注射液浸提条件下细胞毒性分析结果Tab.3 Cytotoxocity analysis results under 0.9%NaCl injection extraction conditions

2.2 以纯化水为浸提介质的试验分析

2.2.1 显微镜观察法

以纯化水作为浸提介质，采用121 ℃×60 min的浸提条件处理供试品，显微镜观察的细胞形态如表4所示。

表4 纯化水浸提条件下细胞形态显微镜观察结果Tab.4 Cell morphology observation by microscope under purified water extraction

2.2.2 四唑盐比色法

以纯化水作为浸提介质，在121 ℃×60 min的浸提条件下处理供试品，显微镜观察的细胞形态如图2所示，四唑盐比色法测定的细胞毒性如表5所示。

从图2可以看出，采用纯化水浸提121 ℃×60 min，细胞形态正常。

图2 纯化水浸提条件下显微镜观察的细胞形态（放大40倍）Fig.2 Cell morphology observed by microscope under purified water extraction（magnified by 40 times）

从表5可以看出：采用纯化水浸提121 ℃×60 min，IR0307的细胞毒性反应等级为1，IR80的细胞毒性反应等级为2，IR0307的细胞毒性小于IR80。

表5 纯化水浸提条件下细胞毒性分析结果Tab.5 Cytotoxocity analysis results under purified water extraction

3 结论

本工作采用显微镜观察法和四唑盐比色法测定聚异戊二烯橡胶体外细胞毒性，根据试验结果有如下初步判断。

（1）采用0.9%NaCl注射液为浸提介质，在37℃×24 h浸提条件下，IR0307和IR80的细胞毒性反应等级均为1。

（2）采用0.9%NaCl注射液为浸提介质，在121℃×60 min浸提条件下，IR0307和IR80的细胞毒性反应等级均为2。

（3）采用纯化水为浸提介质，在121 ℃×60 min浸提条件下，IR0307的细胞毒性反应等级为1，IR80的细胞毒性反应等级为2，IR0307的细胞毒性小于IR80。

（4）聚异戊二烯橡胶采用0.9%NaCl注射液浸提时，由于0.9%NaCl注射液配制的MEM培养基渗透压偏高，在121 ℃×60 min浸提条件下细胞状态为非正常状态，这有待进一步优化。

相关资料显示，引起聚异戊二烯橡胶本身产生细胞毒性的物质主要与橡胶生产过程中所用的催化剂、溶剂、防老剂、抗氧剂以及稳定剂的种类和含量有关，在聚异戊二烯橡胶生产过程中，建议控制催化剂的残留量以及杂质和金属离子的含量和种类，使用洁净的非污染型防老剂和稳定剂。目前，国内生产聚异戊二烯橡胶的企业不断增多，生产规模和产品质量不断提升，但产品主要还是用于非医用橡胶制品，如轮胎、工业橡胶制品、输送带、衬垫和密封件等[16]。随着医用橡胶制品用量和规模的提升，开发生产符合医用要求的聚异戊二烯橡胶并确保聚异戊二烯橡胶的细胞毒性符合相关法规要求是一项很有必要的工作。