高效液相色谱串联质谱法同时测定人血清8种叶酸循环代谢物

李慧敏，刁嘉茵，郑康帝，张 召,3，林炳耀，林东子*（.东莞市滨海湾中心医院，广东东莞 53900；.广东省人体微生态工程技术研究中心，广东广州 5000；3.广东南芯医疗科技有限公司，广东广州 5000；.佛山市第四人民医院，广东佛山 58000）

叶酸及其衍生物5-甲酰四氢叶酸（5-FoTHF，亚叶酸）、5-甲基四氢叶酸（5-MeTHF）、5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH2-THF）和四氢叶酸（THF）等主要影响DNA 合成和DNA 甲基化两个过程[1-2]，可以治疗贫血及神经系统疾病，也可以用作早孕期间预防胎儿畸形[3-9]。在尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP）到胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP）的转化过程中，dUMP 因叶酸缺乏导致积累，错误掺入DNA，进而在DNA 复制和修复过程中诱发基因突变、DNA 单双链断裂、染色体断裂等各种遗传异常[10-11]。叶酸摄入不足将影响同型半胱氨酸（Hcy）代谢途径，导致DNA 和RNA 甲基化异常及改变基因表达，从而引发各类相关疾病的发生[12-13]。随着生活水平的不断提高、三胎政策的放开、出生率的降低等一系列因素，叶酸检测已成为母婴阶段的重要检测指标。目前，临床叶酸检测多以化学发光法为主，常单独测试叶酸及同型半胱氨酸，主要因为此方法具有自动化程度高、重现性好、灵敏度高等优点[14-15]，但化学发光法无法对叶酸代谢中的多种衍生物同时进行检测[15-16]。为协助临床医生明确患者叶酸缺乏的原因，探究叶酸检测指标丰富、检测结果稳定、灵敏度高、叶酸上下游产物共检等要求已成为该领域的难点。本文基于液相串联质谱平台对叶酸代谢过程中的多种关键化合物进行定量检测，以期为临床上叶酸缺乏相关症状的诊治提供参考。

1 资料和方法

1.1 仪器试剂

岛津LC-20AC 型液相色谱仪；岛津CL8050 型质谱仪；乙腈、甲酸铵和甲酸（St.Lous,美国）；去离子水（Millipore、MA、USA）；叶酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF 标准品均购买自Sigma-Aldrich 上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度均大于98%。

1.2 方法

1.2.1 校准品、质控品及提取试剂配制（1）PBS 缓冲液：称取磷酸二氢钾0.24 g，磷酸氢二钠1.44 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，加入去离子水约800 mL 充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH 至7.4，定容至1 L即得。（2）牛血清白蛋白溶液：称取适量牛血清白蛋白，按50 g/L 加入PBS缓冲液溶解，混匀即得。（3）三联抗氧化剂：称取抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇（DTT）适量，加入甲醇，分别配制成1 g/L 甲醇溶液，然后按抗坏血酸:柠檬酸:DTT:水=1:1:1:7 配制成质量浓度为100 mg/L的三联抗氧化剂。（4）储备液配制：称取适量各标准品叶酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF、5,10-CH2-THF、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和Hcy，分别加入三联抗氧化剂，配制成1 g/L的各储备液。（5）混合内标溶液配制：取叶酸内标和Hcy储备液，用三联抗氧化剂稀释成叶酸内标为1 g/L，Hcy为20 g/L 的混合内标溶液。（6）校准品的配置：先将各储备液配制成梯度混合标准品溶液，然后按混标:牛血清白蛋白溶液=1:99 配制成如下质量浓度校准品，见表1。（7）质控品的配置：先将各储备液配制成2个混合标准品溶液，然后按混标:牛血清白蛋白溶液=1:99配制成如下浓度质控品，见表2。（8）提取液配置：提取液1为配制含100 mg/L抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇的甲醇溶液；复溶液2为配制含100 mg/L 抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇的10%乙腈溶液。（9）前处理方法：取100～200 μL 样本（血清、校准品或质控品）至EP 管中，加入5 μL 混合内标溶液和500 μL 提取液1 后涡旋振荡1 min，混匀。离心后转移400～500 μL 上清于96 孔进样板中。氮气吹干，加入100 μL 复溶液2，覆上铝箔封膜，检测备用。将96 孔进样板放入自动进样器中，准备上机。

表1 8种人体叶酸循环代谢物标准品的配置信息（C1-C6为标曲的6个质量浓度，μg/L）

表2 8种人体叶酸循环代谢物质控品的配置信息（μg/L）

1.2.2 测定方法（1）色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱，流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为0.1%甲酸乙腈溶液。流速450 μL/min，柱温40 ℃，进样量5 μL，洗脱梯度见表3。（2）质谱条件：在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM (Multi Reaction Monitoring)扫描分析，离子源参数雾化气流量为3 L/ min，干燥气流量为2 L/min，加热气流量为15 L/min。DL 管(Dashlaunch)温度为100～400 ℃，接口温度为100～400 ℃，加热块温度为100～400 ℃，碰撞诱导裂解气压为100～300 kPa，前体与产物离子通道见表4。

表3 8种人体叶酸循环代谢物流动相洗脱信息

表4 8种人体叶酸循环代谢物液质检测前体与离子碎片信息

1.2.3 方法学探究 低、中、高浓度的质控样本分别在提取前和提取后加入内标，按样品处理方法进行样本提取与上机检测，分析方法的精密度。同一样本平均分成6 份，前3 份每份按样本提取方法提取后分别加入低、中、高浓度的内标作为组1 质控样本上机检测；后3 份每份分别加入低、中、高浓度的内标按提取方法提取后作为组2质控样本上机检测回收率。

2 结果

2.1 标曲线性范围与检测限

8种人体叶酸循环代谢物的总离子流图谱见图1。各叶酸循环代谢的线性相关系数为0.994～0.999，表明线性关系良好，最低检出限为0.128 μg/L。采用内标进行定量，叶酸、5-FoTHF、5-MeTHF、THF、5,10-CH2-THF 均共用叶酸内标。SAM、SAH 和Hcy 共用Hcy 内标。以校准品待测物峰面积与对应内标峰面积的比值作为纵坐标（y），以各校准品的质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。标准曲线拟合后，相关系数r＞0.99。此外质控品测试准确度符合85%～115%，各个指标的检测限及定量限如表5所示。

表5 8种人体叶酸循环代谢物的回归方程、相关系数、准确度及检测线

图1 8种人体叶酸循环代谢物总离子流图谱

2.2 精密度与准确度

由表6 可知，8 种人体叶酸循环代谢物精密度RSD 值为3.9%～12.3%，回收率RSD 值为85.4%～113.1%，精密度良好，回收率较高，说明方法的准确度良好。

表6 8种人体叶酸循环代谢物的精密度及回收率

2.3 样本检测结果

分别取儿童、孕妇志愿者样本各50份，按1.2.1方法处理后，测定叶酸循环代谢产物含量，结果范围如表7所示。

表7 样本检测结果

3 讨论

叶酸是促进机体健康的重要物质，是人体细胞生长和繁殖的必须物质，在造血系统中对红细胞形态和代谢有着重要的作用[17]。叶酸可以协助胎儿发育，预防胎儿神经管畸形的发生，准妈妈在备孕期间服用叶酸可大幅度降低胎儿神经管畸形率[18]。同时，叶酸与同型半胱氨酸代谢关系密切，对预防心血管疾病的发生具有重要的意义[13]。随着生活水平的不断提高、三胎政策的放开，叶酸保健品的市场占有份额不断增大，但由于缺乏科学的指导，叶酸使用现状混乱。因此，通过检测人体内叶酸及其循环代谢物的真实状态，针对性地调整、明确叶酸潜在需求，更符合个性化治疗要求。

饮食摄入的叶酸主要以多聚谷氨酸盐的形式，叶酸代谢首先在肠黏膜上水解，二氢叶酸转移酶先是将叶酸还原为二氢叶酸，再生成四氢叶酸。四氢叶酸产生甲酰基、甲基、亚甲基等叶酸形式底物，亚甲基四氢叶酸经甲基四氢叶酸还原酶催化转变为5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸即是叶酸在血液的主要形式。当前，临床在进行叶酸检测分析时，不能明确全部叶酸循环代谢产物的含量，大大限制了医生对患者叶酸缺乏的判断。为此，临床急需一种可同时、快速、准确检测人体叶酸循环代谢物的方法。检测叶酸的主要方法为高效液相色谱法、时间分辨法、免疫化学发光法。免疫化学发光法稳定性较好但特异性差，高效液相色谱法灵敏度高但稳定性差，但这几种方法均难以同时检测多种叶酸循环代谢产物指标[16]。

本文基于液相串联质谱全面对叶酸代谢过程中的多种关键化合物进行定量检测，方法高效、灵敏，检测下限较低，准确度高，能对整个叶酸代谢水平进行全面评估[19]，可满足人体叶酸循环代谢物常规测定的要求，但其普适性有待进一步的研究确定。