高效液相色谱法测定蒿板青颗粒中一枝蒿酮酸及(R, S)-告依春的含量

皇甫通，冯清强，周家平，马成俊，毛瑞华，杨 磊，李 岩，王振华*

(1.烟台大学生命科学学院，烟台264005；2.烟台海研制药有限公司，烟台264005)

新兽药蒿板青颗粒的原处方为人用药复方一枝蒿颗粒，其收载于《国家中成药标准汇编》内科肺系(一)分册(WS-10018(ZD-0018)-2002)，具有解表祛风，凉血解毒，用于邪毒所致的感冒发烧，咽喉肿痛，病毒性感冒的治疗。该处方在常用中药复方板蓝根颗粒(成分：板蓝根、大青叶)的基础上，加入具有清热解毒的维药新疆一枝蒿组方，板蓝根、大青叶与新疆一枝蒿的生药比例为1∶1∶1，经过水提醇沉、浓缩、加工制粒而成[1]，体外活性研究及多年临床应用表明，和复方板蓝根颗粒相比该药物在抗炎、抗菌、抗病毒及免疫调节等方面显示出更为优良的疗效[2-6]。兽药板青颗粒收载于《中国兽药典》2015版二部，由板蓝根和大青叶两味中药材经水煎煮、滤过和浓缩、加工制粒而成，具有清热解毒、凉血功效，广泛用于畜禽风热感冒、咽喉肿痛、热病发斑等温热性疾病防治。鉴于此，我们在多年生产使用兽药板青颗粒的基础上，对人用药复方一枝蒿颗粒的生产工艺和针对畜禽风热感冒初步药效学进行了系统研究，比较其相对于板青颗粒的优势，决定将其开发为用于防治兽禽温热性疾病的药物，命名为“蒿板青颗粒”，现已完成临床前及临床研究。人用药“复方一枝蒿颗粒”、“复方板蓝根颗粒”和“兽药板青颗粒”质量标准中均无有效物质定量控制方法，实验针对蒿板青颗粒制备工艺特点及兽药质量控制要求，以新疆一枝蒿的有效物质一枝蒿酮酸和板蓝根中的有效物质(R, S)-告依春为指标成分，研究建立了高效液相色谱法同时测定蒿板青颗粒中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的方法，并根据《兽药质量标准分析方法验证指导原则》的要求[7]，对上述方法进行了验证，为蒿板青颗粒的质量控制提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 一枝蒿酮酸对照品，批号：20190522，中国科学院新疆理化技术研究所；(R,S)-告依春对照品，批号：111753-201706，中国食品药品检定研究院；三批蒿板青颗粒中试样品(批号：190201、190202、190203)，烟台海研制药有限公司提供；不含新疆一枝蒿及板蓝根的阴性对照样品(自制)；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司，水为超纯水(自制)。

1.2 仪器 Sartorius十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；Agilent 1260四元高效液相色谱仪配1260 UV检测器(美国Agilent公司)；DSA300-SK1-12L型超声波清洗机(福州仟度电子仪器有限公司)。全波长紫外扫描仪uv-9000(上海元析仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择 以甲醇做为溶剂，将一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春对照品分别制成10 μg/mL的溶液，在200～400 nm波长范围下扫描，结果见图1。一枝蒿酮酸的λmax=245 nm；(R, S)-告依春的λmax=243 nm，参考文献资料[9-13]，确定245 nm做为高效液相色谱的检测波长。

图1 一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的紫外光谱图Fig 1 UV spectra of Rupestonic acid and (R, S)-epigoitrin

表1 含量测定梯度洗脱条件Tab 1 Gradient elution condition for content determination

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液制备 取一枝蒿酮酸对照品约30 mg，(R, S)-告依春对照品约6 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含有120 μg /mL(R, S)-告依春与600 μg /mL一枝蒿酮酸对照品混合储备液；精密量取对照品混合储备液1.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为7.2 μg /mL(R, S)-告依春与36 μg /mL一枝蒿酮酸的对照品混合溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 取蒿板青颗粒(批号：190201)，研磨成粉，取约6 g细粉，精密称定，置于100 mL具塞容量瓶中，精密量取50 mL 80%甲醇，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足损失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取滤过液，即得。

2.3.3 阴性对照溶液制备 按照处方量及制备工艺，分别制备辅料、不含新疆一枝蒿、不含板蓝根的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备空白溶液和阴性样品溶液。

2.4 系统适用性和专属性试验 分别量取空白溶液、一枝蒿酮酸与(R, S)-告依春对照品混合溶液、蒿板青颗粒溶液和阴性对照溶液，按 2.2项色谱条件测定，结果见图2。在该色谱条件下，一枝蒿酮酸的保留时间在36 min 左右，(R, S)-告依春的保留时间在9 min左右，分离度达到1.5以上，理论塔板数大于3000，阴性样品在此时间附近无吸收峰。结果表明，系统适用性可以满足检测要求；处方中其它成分对一枝蒿酮酸与(R, S)-告依春定量检测无干扰，说明该方法能满足检测要求。

(A)空白溶液(辅料)；(B)混合对照；(C)阴性样品(缺板蓝根);(D)阴性样品(缺新疆一枝蒿);(E)蒿板青颗粒；a. (R, S)-告依春；b. 一枝蒿酮酸(A)Blank solution;(B)Control；(C)Negative sample (Lack Radix Isatis tinctoria Fort.)(D)Negative sample (Lack Artemisia rupestris L．);(E)Haobanqing granules； a. (R, S)-epigoitrin; b. Rupestonic acid图2 样品中(R,S)- 告依春与一枝蒿酮酸高效液相图Fig 2 HPLC chromatogram of (R, S)-epigoitrin and Rupestonic acid in sample

2.5 线性关系考察 精密量取混合储备液1、1.5、2、3、4、5 mL，分别置于25 mL的容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，一枝蒿酮酸的浓度分别为：24、36、48、72、96、120 μg /mL；(R,S)-告依春的浓度分别为4.8、7.2、9.6、14.4、19.2、24 μg /mL。按照2.2项下的色谱条件分别进样，测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，作线性回归，一枝蒿酮酸的回归方程为y= 57.667x-120.680，R2=0.9992；(R,S)-告依春的回归方程为y= 152.340x-274.890，R2=0.9997。一枝蒿酮酸在24～120 μg/mL范围内呈现良好的线性关系；(R, S)-告依春在4.8～24 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验 取线性试验项下的混合贮备液(一枝蒿酮酸的浓度为600 μg /mL，(R, S)-告依春的浓度为120 μg /mL)3 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按 2.2 项下的色谱条件重复测样6次，测定峰面积，结果显示，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春相对标准偏差RSD分别1.72%、1.50%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液(批号190201)，制备成适宜浓度，按照2.2项下的色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、12 h 测定，根据峰面积值，分别计算样品中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的平均含量变化。结果显示，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的平均含量分别为226.57和31.49 μg/g，RSD分别为1.38%和1.63%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 重复性试验 取供试品溶液6份(批号190201)，制备成6份适宜浓度的供试品溶液，按照2.2项下的色谱条件测定各自一枝蒿酮酸和(R,S)-告依春的含量。结果显示，6份同一批次样品中一枝蒿酮酸的平均含量为 226.32 μg/g，RSD为1.25%；(R, S)-告依春的平均含量为32.27 μg/g，RSD为2.08%，表明该方法有良好的重现性。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的板青蒿颗粒(批号190201)样品约6.0 g，共15份，置于100 mL容量瓶中，平均分为5组，每组分别精密加入浓度为600 μg /mL的一枝蒿酮酸对照品溶液1.8、2.25、2.7 mL和浓度为120 μg /mL的(R, S)-告依春对照品溶液1.42、1.13、1.7 mL，用80%甲醇溶解并定容至刻度，密塞，精确称定重量，超声30 min，放冷，称定重量，用80%甲醇补足损失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过。取滤液，按照2.2项下的色谱条件，各取20 μL注入色谱仪进行测定，记录色谱峰面积，计算加样回收率，结果见表2。由实验结果得知，3组样品中一枝蒿酮酸的平均加样回收率分别为98.4%、97.9%和98.1%，RSD分别为1.31%、1.02%和1.33%；3组样品中(R,S)-告依春的平均加样回收率分别为98.8%、98.3%和97.5%，RSD分别为0.56%、0.88%和1.14%，均符合相关要求。

表2 加样回收率(n=5)Tab 2 Recovery test data sheet

2.10 耐用性

2.10.1 不同色谱柱耐用性试验 取供试品溶液(批号190201)，制备成适宜浓度，按照2.2项下的色谱条件，分别用SUPELCO ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Prodigy ODS-3V C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)和Thermo Scientific ODS C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm) 三个不同厂家的色谱柱，每个色谱柱进样2次，测定一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的含量，结果见表3。同一供试品在更换不同色谱柱下进行测定，一枝蒿酮酸的RSD为0.90%；(R, S)-告依春的RSD为1.27%。结果表明该方法对不同厂家的色谱柱耐用性良好。

表3 不同色谱柱耐用性试验Tab 3 Serviceability test of different chromatographic column

2.10.2 不同分析人员耐受性试验 取供试品溶液(批号190201)，制备成适宜浓度，按照2.2项下的色谱条件，由实验室3位分析人员每人制备1份供试品溶液，在同一色谱仪上各自操作测定自己制备样品中一枝蒿酮酸和(R,S)-告依春的含量，每人进样2次，记录峰面积，计算6次测定含量变化，结果见表4。3人6次测定同一样品的一枝蒿酮酸RSD为0.85%；(R,S)-告依春的RSD为1.43%，表明该方法在不同分析人员间的耐受性良好。

表4 不同分析人员的耐受性实验Tab 4 Serviceability test of different analysts

2.11 样品检测 取三批中试样品(批号190201、190202、190203)，按以上确定的高效液相色谱法，每批次取样两份进行测定，计算平均含量，结果见表5。通过对3批次中试样品含量分析，一枝蒿酮酸的含量在224.66～229.28 μg/g之间；(R, S)-告依春的含量在30.95～33.40 μg/g之间，因此将蒿板青颗粒的质量标准含量限量暂定为：一枝蒿酮酸的含量不得低于220 μg/g；(R, S)-告依春的含量不得低于30 μg/g，待以后通过对多批次的样品分析后，再科学地确定其限量。

表5 样品含量测定Tab 5 Content determination results of 3 batches of samples

3 讨论与结论

3.1 含量测定方法的选择 蒿板青颗粒的原处方为人用药复方一枝蒿颗粒，而复方一枝蒿颗粒是在常用中药复方板蓝根颗粒(成分：板蓝根、大青叶)的基础上，加入具有清热解毒的维药新疆一枝蒿组方，经过水提醇沉、浓缩、加工制粒而成，该标准没有有效物质含量测定方法。现有研究资料表明，新疆一枝蒿中含有黄酮类、倍半萜类、苷类、挥发油、生物碱等，其中一枝蒿酮酸是主要有效成分，具有显著的抗炎、抗病毒活性[9]。大青叶中的主要活性成分有靛蓝、靛玉红等；板蓝根中的主要活性成分有靛蓝、靛玉红及核苷类成分，这些成分具有抗病毒、消炎抑菌、抗氧化等药理活性[10]。已有报道采用高效液相色谱法测定新疆一枝蒿、复方一枝蒿制剂中有效物质一枝蒿酮酸、大青叶中的有效成分靛玉红和板蓝根中的有效物质(R, S)-告依春[11-14]。2017版《兽药质量标准瘙簚中药卷》中板蓝根注射液含量测定指标成分为(R, S)-告依春。我们前期药学研究表明，大青叶、板蓝根中的靛蓝、靛玉红在药材和制剂提取、制备及贮藏过程中稳定性差，不适合做为指标成分控制质量，本实验针对蒿板青颗粒制备工艺特点及兽药质量控制要求，以新疆一枝蒿的有效物质一枝蒿酮酸和板蓝根中的有效物质(R, S)-告依春为指标成分，研究建立了高效液相色谱法同时测定蒿板青颗粒中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的方法，并对测定方法进行了系统的考察，结果表明该方法操作简便，一枝蒿酮酸在24～120 μg/mL范围内；(R, S)-告依春在4.8～24 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，方法准确度、精密度、稳定性和耐用性均能达到检测要求。

3.2 样品前处理方法的选择 试验表明，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春告依春易溶于甲醇，我们采用不同浓度的甲醇溶液超声提取，并考察了超声时间和提取次数，结果显示以80%甲醇溶液超声提取30 min，可以将样品中的一枝蒿酮酸与(R, S)-告依春提取完全。

3.3 流动相的优选 本处方由三味药材组成，所含成分复杂，待测指标成分一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春化学结构和极性存在巨大差异。经采用不同比例的甲醇：0.4%磷酸水溶液和乙腈：0.4%磷酸酸水溶液等度洗脱，均不能实现待测物质和杂质的有效分离，峰型对称性差，检测时间过长，并且以甲醇：0.4%磷酸水溶液洗脱，一枝蒿酮酸色谱峰拖尾明显。为此，以乙腈：0.4%磷酸为洗脱剂，采用二元高效液相色谱，对线性洗脱条件进行了优选，最终选择的方法为：流动相为乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0 min，5% A；0～10 min，5% A→15% A；10～25 min，15% A→30% A；25～40 min，30% A；40～41 min，30% A→5% A；41～45 min，5% A)，检测波长245 nm，流速为1.0 mL/min，柱温35 ℃。在该色谱条件下，(R, S)-告依春的保留时间在9 min左右，一枝蒿酮酸的保留时间在36 min 左右，理论塔板数均大于3000，阴性样品对应时间附近无吸收峰，待测物质和杂质间得到很好分离。

研究建立的高效液相色谱法测定新兽药蒿板青颗粒中有效物质一枝蒿酮酸与(R, S)-告依春含量的方法，结果表明，该方法操作简便，重复性好，准确度高，为进一步控制新药蒿板青颗粒的质量提供了理论依据。