四倍体滋养层干细胞的分离培养与鉴定

王海豫，肖 翼，黄 粤

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学遗传学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

干细胞(stem cells,SCs)是一类具有自我更新和分化能力的细胞，是早期胚胎研究中重要的体外模型。从小鼠囊胚的内细胞团、滋养外胚层和原始内胚层可得到胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)系[1]、滋养层干细胞(trophoblast stem cells, TSCs)系[2]和胚外内胚层(extraembryonic endoderm,XEN)细胞系[3]。滋养外胚层参与到胎盘形成，围绕在内细胞团上部的滋养层干细胞发育成滋养外胚层和外胎盘锥，其余的则发育成滋养层巨细胞[4]。

多倍体细胞常见于植物中，但在哺乳动物的部分组织器官中也存在少量多倍体细胞。在人体内，不同的组织中出现多倍体细胞的概率是0.5%～2%[5]，如骨髓的巨核细胞、胎盘中的滋养层细胞等[6]。在四倍体补偿实验(tetraploid complementation assay)中，将二倍体ESCs注射到四倍体囊胚中，经发育可以最终得到完全由二倍体ESCs发育而来的个体[7]，四倍体胚胎发育成的胎盘等胚外组织，支持胎儿的发育。但四倍体细胞发育的胎盘与正常的二倍体细胞发育的胎盘有什么差异，目前尚不清楚。此外，四倍体ESCs系已经成功建立，与二倍体ESCs仅能嵌合到胎儿组织的发育潜能不同，四倍体ESCs可以嵌合到胚胎期第13.5天(embryonic day 13.5, E13.5)和第16.5天(E16.5)小鼠的胎盘、胎膜等胚外组织中[8]。然而，四倍体滋养层干细胞(trophoblast stem cells,TSCs)与二倍体TSCs相比，其发育潜能有哪些不同。以往报道的调控滋养层细胞功能的基因[9]，在多倍体细胞中如何进行调控，尚未进行探究。四倍体滋养层干细胞(tetraploid TSCs, TTSCs)系将有助于解决这些问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:野生型小鼠ESCs系AB2.2，遗传背景为129S7/SvEvBrd，由英国The Wellcome Trust Sanger研究所Allan Bradley教授惠赠。野生型小鼠TSCs系、 TTSCs系，遗传背景为ICR(Institute of Cancer Research来源)，由本实验室自行建系获得。小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)制作成饲养层细胞，由本实验室制备。

1.1.2 实验动物: 实验用小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心[许可证号：SYXK(京)2020-0025]，环境符合SPF级动物饲养标准。

1.1.3 试剂:Knockout DMEM培养基、RPMI 1640培养基、GlutaMAXTM、丙酮酸钠、MEM 非必需氨基酸溶液、青链霉素及β-巯基乙醇(Gibco公司)；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)(Millipore公司)；血清(Hyclone公司)；成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor 4,FGF4)(Peprotech公司)；肝素(heparin)、M2培养基(Sigma-Aldrich公司)；Y27632(MCE公司)；KSOM培养基(Merck公司)；TB Green Taq(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 ESCs的培养:培养基M15L由Knockout DMEM、15% FBS、GlutaMAXTM、MEM NEAA、青链霉素、β-巯基乙醇、LIF(1 000 U/mL)配制而成。

1.2.2 TSCs的培养:培养基TS+F4H：先由RPMI1640、20% FBS、GlutaMAXTM、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、青链霉素组成TS培养基，再添加FGF4(25 ng/mL)、肝素(1 μg/mL)组成TS+F4H培养基。

1.2.3 TTSCs的培养:MEF条件培养基(condition-ed medium, CM)：用TS培养基培养X-射线处理的MEF细胞，3 d后收集上清，2 300×g4 ℃离心20 min，0.45 μm滤器过滤，即为MEF-CM。TTSCs的培养基70CM+1.5×F4H+Y27632：70% MEF-CM、30% TS培养基、FGF4(37.5 ng/mL)、肝素(1.5 μg/mL)、Y27632(20 μmol/L)组成。

ESCs、TSCs和TTSCs均接种在X线处理的饲养层MEF细胞上培养。细胞汇合度达到70%～80%时，以1∶5 ～1∶10比例进行传代。

1.2.4 TTSCs的分离:用M2培养基收集2-细胞期胚胎，清洗后置于电融合仪中，融合电压30 V/ram，脉冲时程50 s，脉冲次数1次。1 h后选择发生融合的胚胎在KSOM培养基中培养。3 d后每3枚囊胚移入到MEF细胞包被的12孔板的一个孔中，使用TS+F4H培养，胚胎贴壁后更换新的培养基。3～5 d后，外长细胞团(outgrowth)直径达到600～800 μm，将其挑出消化成单细胞后，接入到MEF细胞包被的培养板中,使用70CM+1.5×F4H+Y27632培养。待长出单层上皮样的克隆后，挑取克隆，传代扩增。

1.2.5 实时荧光定量PCR:提取细胞的总RNA并反转录为cDNA，用TB Green Taq进行RT-qPCR反应。引物序列见表1，GAPDH为内参基因。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6 细胞免疫荧光:细胞培养2～3 d后，4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1% Triton X-100室温孵育20 min进行通透处理，3% BSA溶液封闭30 min。加入CDX2(1∶200)、EOMES(1∶200)一抗4 ℃孵育过夜。次日加入二抗及Hoechst 33342稀释液避光染色30 min。封片并使用共聚焦显微镜观察。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达:TTSCs消化并去除MEF细胞后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，BCA法测定蛋白浓度。取20 μg样品进行检测，电泳、转膜后，一抗CDX2(1∶1 000)、OCT4(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育过夜。TBST清洗后，二抗室温孵育1 h，化学发光仪检测。GAPDH作为内参。

1.2.8 中期染色体计数:处于对数生长期的细胞加入0.2 μg/mL秋水仙素，3 h后将细胞消化成单细胞，0.5% KCl 37 ℃水浴中低渗处理30 min。新配制固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)室温固定细胞20 min，重复1次。细胞悬液滴于冰冷洁净的载玻片上。过夜晾干，Giemsa染液染色5 min，蒸馏水冲洗晾干后，显微镜下观察计数染色体数目。

1.2.9 慢病毒感染TTSCs:用PCR将2A-tdTomato元件克隆至pLVX-EF1α-eGFP-IRES-puro慢病毒表达质粒，得到pLVX-EF1α-eGFP-2A-tdTomato-IRES-puro质粒, 作为核心质粒进行慢病毒包装(由北京伊美昂生物科技有限公司制作)。

处于对数生长期的TTSCs接种到12孔板中，次日更换含polybrene(6 μg/mL)和慢病毒的无双抗70CM+1.5×F4H +Y27632培养基，感染4 h后换液。48 h后，荧光显微镜下观察评估感染效率。在培养基中加入puromycin(5 μg/mL)进行筛选，获得成功感染的细胞。

1.2.10 8-细胞期胚胎的显微注射及嵌合胎盘的观察:体质量12～14 g ICR雌鼠作为胚胎供体鼠，每只注射10 U血促性素，间隔48 h后，注射10 U 绒促性素，与雄鼠合笼。次日晨挑取见阴道栓雌鼠，当天记为E0.5 d(0.5 d)。在E2.5 d(2.5 d)时，用M2培养基收集8-细胞期胚胎。

将eGFP-2A-tdTomato标记的TTSCs消化成单细胞，每个8-细胞期胚胎注射进入5个细胞。注射后的胚胎放入KSOM培养基中培养。次日选取发育较好的囊胚进行子宫移植。E13.5(13.5 d)时，取子代小鼠胎盘进行观察，检测荧光标记细胞的嵌入情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 电融合后的胚胎建立滋养层样细胞系

2-细胞期胚胎经电融合后形成四倍体胚胎,体外培养至囊胚阶段(图1A)，将其接种到MEF细胞包被的培养板中，用TS+F4H培养基进行培养。囊胚从透明带中孵出，贴壁生长形成外长细胞团(outgrowth)(图1B)。挑出的outgrowth重新接种，在培养板中增殖生长形成新的细胞团(图1C)，细胞团继续传代培养，待出现较多形态类似于TSCs的克隆后，挑取TSCs样克隆继续培养，得到可稳定培养的TTSCs系(图1D)。

A.mouse tetraploid blastocysts (scale bar=100 μm); B.outgrowth from tetraploid blastocysts(scale bar=200 μm); C.cell aggregates from outgrowth (scale bar=200 μm); D.cultured TTSCs that can be passaged stably (scale bar=200 μm)

2.2 鉴定四倍体滋养层干细胞系

对来自融合胚胎的TSCs样细胞系进行中期染色体计数后，超过60%样品的染色体数目为80条，为正常二倍体细胞染色体数目的两倍，说明所建立的细胞系为四倍体(图2A)。在转录水平检测上述细胞系中标志基因的表达，发现不同的TSCs样细胞系TTSCs-1和TTSCs-2均表达TSCs特异基因CDX2和EOMES，不表达ESCs特异性基因OCT4(图2B)。Western blot(图2C)和免疫荧光(图2D)结果分别验证了TTSCs高表达CDX2、EOMES等因子。以上结果表明由融合胚胎建立的TSCs样细胞系为四倍体细胞，并表达TSCs的标志基因。

A.representative chromosome spreads and chromosome counting of TTSCs lines(×400); B.RT-qPCR analysis of TSCs marker gene (CDX2, EOMES, GATA3) and ESCs marker gene (OCT4) in TTSCs-1/2, TSCs, n=3), compared with TSCs; C.Western blot analysis of CDX2 and OCT4 in TTSCs-1/2, TSCs, ESCs; D.immunofluorescence staining of CDX2 and EOMES

2.3 TTSCs的体外分化

TTSCs在增殖条件下(图3A)和分化条件下(图3B)的细胞形态不同，在分化条件下(TS培养基)，TTSCs的细胞核明显增大，具有滋养层巨细胞的形态特征。用RT-qPCR对TTSCs进行滋养层巨细胞标志基因PL-1、PL-2、HAND1、GATA3的检测。结果显示，分化标志基因在不同的时间点，TSCs与TTSCs的表达量存在显著差异(P<0.0001)(图3C)。

A.the morphology of TTSCs clone under proliferation condition and DAPI stained nuclei(scale bar=100 μm); B.the morphology of TTSCs clone under differentiation condition and DAPI stained nuclei(scale bar=100 μm); C.RT-qPCR analysis of the expression of PL-1，PL-2，GATA3 and HAND1 under differentiation n=3); *P<0.000 1 compared with TSCs at day 0

2.4 TTSCs的体内分化

通过慢病毒感染的方法得到同时带有tdTomato和eGFP标记的TTSCs(图4A)。将其注射入8-细胞期胚胎中(图4B)，并培养至囊胚期，可观察到部分荧光标记过的细胞分布在囊胚的滋养层部分(图4C)。将囊胚移植入假孕雌鼠体内发育至E13.5(13.5 d)，子代鼠的胎盘组织中可检测到具有双荧光标记的细胞(图4D)。

A.TTSCs were labeled with dual fluorescent reporters of tdTomato and eGFP(scale bar=100 μm); B.TTSCs were microinjected into the 8-cell embryo(scale bar=100 μm); C.blastocysts cultured for 24 hours in vitro after microinjection(scale bar=100 μm); D.the E13.5 placenta dissected for observation(scale bar=2 mm); the two amplified pictures are matched with circled part of the above pictures(scale bar=1 mm)

3 讨论

本研究使用电融合的方法，获得了四倍体胚胎，借鉴二倍体[10]及单倍体[11]TSCs的建系方法，经过建系条件和培养条件的反复测试，建立了TTSCs系，并确定了70CM+1.5×F4H+Y27632的培养条件可以稳定维持TTSCs的生长。建立的TTSCs细胞系均表达TSCs标志基因CDX2、EOMES。与二倍体TSCs相比，TTSCs培养基中需要添加更高浓度的肝素和FGF4以维持其增殖状态，并且需要添加Rock 抑制剂Y27632,否则细胞会分化成滋养层巨细胞，说明其本身可能就具有更强的分化倾向。后续的分化实验也显示，在体外培养条件下，TTSCs的分化标志基因表达水平与TSCs存在显著差异。说明在生长及分化过程中，TTSCs与TSCs并不完全相同。显微注射实验也证明，TTSCs可以参与到胎盘的发育中，表明TTSCs具有良好的体内发育潜能。

Wen[8]等建立的四倍体ESCs可嵌合入胚外组织，说明细胞染色体组多倍化会改变细胞的命运决定机制及发育分化方向。通过体外建立的TTSCs可以进一步分析和研究四倍体胚胎滋养层细胞的生长及分化特点，解释细胞染色体组多倍化对细胞生命活动的影响。

综上，本研究建立的TTSCs为研究多倍体细胞在动物生理过程中的功能和胎盘早期发育提供了重要的细胞模型，也为深入了解胎盘发育不良导致的流产、难产等问题提供了新的研究思路。