冷甲醇固定时间与不同组织冷冻切片染色质量的相关性分析

王岩 梁静

（河南科技大学第一附属医院病理科，河南 洛阳 471003）

冷冻切片是将术间组织冷冻至硬块并将其切片，并作为诊断依据的有效方法。因其制作方便、快捷，故多用于术间病理诊断[1-2]。然而，诊断进程受切片制作时长及染色效果影响，如固定液选择种类、染色剂设备、固定时长等[3-4]。目前，无水乙醇、95%乙醇、冷甲醇、无水乙醇乙醚混合液是临床常见冷冻液，其中冷甲醇是相关报道中最受认可的固定液，其固定效果较为理想，且染色结果稳定可靠，便于操作。但临床对冷甲醇的固定时间尚无定论，且冷甲醇用于不同组织冷冻切片染色质量的研究也相对少见。本研究拟分析冷甲醇固定时间与不同至组织冷冻切片染色质量关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

抽取2018年5月至2020年5月我院病理科获得明确石蜡切片病理诊断结果的119例冷冻标本，其中乳腺结节45例、卵巢肿物41例、甲状腺肿物19例、肺部结节14例。根据冷甲醇固定时间分为A组（40s）、B组（60s）、C组（80s），A组（n＝39例）：乳腺结节、卵巢肿物、甲状腺肿物、肺部节结分别为14例、6例、5例、14例；B组（n＝39）：乳腺结节、卵巢肿物、甲状腺肿物、肺部节结分别为15例、7例、5例、12例；C组（n＝41）：乳腺结节、卵巢肿物、甲状腺肿物、肺部节结分别为16例、6例、4例、15例，三组冷冻标本比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究符合2013 年修订的《赫尔辛基宣言》的要求。

1.2 方法

制片：放置冷甲醇固定液于冷冻机（品牌：深圳安亿达有限公司；型号：AYD-05A）内进行预冷，制冷温度为-10℃~50℃，同时将术间取下组织速冻，使用美国樱花OCT冷冻切片包埋剂（品牌：美国樱花SAKURA；货号：4583；产品规格：118 ml/支），使用期间要清楚包埋剂所生成的气泡。待组织物变硬后，使用切片机（英国Campden Instruments，型号：7000 smz /5100 mz）切片，设置厚度为6～77 μm，连切5张，按A、B、C组冷甲醇固定时间实施，水洗；苏木素染色时间为50 s，使用自来水清洗，碳酸钾水溶液（0.05%）于15 s后返蓝，伊红（1%）20 s，梯度酒精脱水，二甲苯I、II均15 s透明，最后选择中性树胶进行封片。

1.3 观察指标

1.3.1 比较三组不同冷冻标本的染色情况

选择我科读片经验≥5年医师，根据石蜡切片评定标准[5]，评估全部冷冻切片，并给予评分。0分：无法区分细胞形态，细胞核膜模糊，核质难以对比，且染色质较为松散；1分：细胞形态及其内部结构均较为完整，细胞核膜、核质染色达到区别标准；2分：细胞形态及其内部结构、核膜均完整、清晰，核质染色区分显著，但染色质未明显收缩。

1.3.2 比较三组不同冷冻标本的病理分型诊断结果

以石蜡切片病理诊断结果为诊断金标准进行比较。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±SD）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组不同冷冻标本的染色情况

将石蜡切片作为对照组。B、C冷冻标本质量优于A组，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 三组不同冷冻标本的染色情况（±SD，分）

表1 三组不同冷冻标本的染色情况（±SD，分）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与A组相比，aP＜0.05。

组别 乳腺结节 卵巢肿物 甲状腺肿物 肺部节结 A组（n＝39） 0.11±0.01* 1.33±0.14* 0.22±0.01* 0.20±0.02* B组（n＝39） 1.54±0.15a 1.53±0.20 1.47±0.12a 1.52±0.20a C组（n＝41） 1.61±0.10a 1.46±0.18 1.55±0.15a 1.46±0.18a 对照组（n=119） 1.58±1.13 1.50±0.19 1.51±0.13 1.49±0.19

2.2 三组不同冷冻标本的病理分型

以石蜡切片病理诊断结果为诊断金标准，A组、B组、C组乳腺结节病理分型诊断准确率分别为85.71%（12/14）、93.33%（14/15）、100.00%（16/16）；卵巢肿物病理分型诊断准确率分别为66.67%（4/6）、71.43%（5/7）、83.33%（5/6）；肺部节结节病理分型诊断准确率分别为85.71%（12/14）、91.67%（11/12）、86.67%（13/15）。三组不同冷冻标本病理分型诊断准确率比较无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本研究B、C冷冻标本质量优于A组，说明乳腺结节、卵巢肿物、甲状腺肿物、肺部节结使用冷甲醇固定液时，不同时间所呈现的染色质量不一，其中冷甲醇固定时间为60 s、80 s时，不同组织冷冻切片染色质量均较优。石蜡切片能准确定位组织细胞，长期保存标本，维持较好组织细胞形态，但保真性较差，易在组织固定、脱水、透明等环节中影响抗原性质，且操作步骤比石蜡切片更为繁琐。冷冻切片对抗原保真显著，且染色过程简单，适合新鲜组织制片，且固定、染色效果均较佳，多应用于手术中的快速病理诊断[3-4]。此外，B、C组冷冻标本在达到最佳制片情况下有效检出冷冻标本的不同病理分型，说明若冷冻切片质量达标，同一病理组织使用同一固定液后，其病理分型固定时间基本接近。同时，本研究以石蜡切片病理诊断结果为诊断金标准，A组、B组、C组乳腺结节、卵巢肿物及肺部节结节病理分型诊断准确率均高于75%，三组不同冷冻标本病理分型诊断准确率比较无显著差异，可能与本研究标本数量尤其是不同病理分型冷冻标本数量较少有关。此外，切片质量还与其他环节有关，如切片固定后使用冷风干燥可降低脱片概率。但也有与之相反结论，认为无论冷风或热风均无法降低脱片概率，且冷热风有损切片染色质量，尤其是淋巴组织[5]。因此，本研究认为，冷甲醇固定时间为60s、80s时，不同组织冷冻切片染色质量均较优，但其对最终诊断结果的影响不显著。而最佳冷冻切片需要探索固定时间、液体、材料等诸多环节，寻找最佳组织并将其合力，才能为临床诊断提供较好依据。