LINC00963通过miR-146a-5p/NFE2L1轴调控胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

徐万苏,柯 飞,许 怡,郑 艺

徐万苏,衢州市人民医院肿瘤放疗科 浙江省衢州市 324000

柯飞,衢州市人民医院病理科 浙江省衢州市 324000

许怡,郑艺,衢州市人民医院消毒供应中心 浙江省衢州市 324000

0 引言

胃癌是全球常见癌症,死亡率高,靶向治疗是改善晚期和转移性胃癌治疗效果的重要方法,开发新型靶向药物,可个性化治疗并改善胃癌患者预后[1-3].研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA)参与胃癌的发生发展过程,提示其在胃癌发生中的作用可用于胃癌的诊断、治疗和预后[4,5].研究报道敲低长基因间非编码RNA 00963(long intergene non-coding RNA 00963,LINC00963)显著抑制了黑色素瘤细胞的增殖,迁移和侵袭[6].LINC00963通过miR-378g/壳多糖酶3样蛋白1(chitosan enzyme 3-like protein 1,CHI3L1)轴促进卵巢癌的增殖,迁移和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)[7].LINC00963充当miR-625的分子海绵上调高迁移率蛋白家族A1(high mobility protein family A1,HMGA1),从而促进乳腺癌的进展[8].然而LINC00963对胃癌细胞增殖,迁移侵袭的影响及机制尚不清楚.

研究发现胃癌细胞中miR-146a-5p下调表达,且胃癌组织低表达的miR-146-5p与静脉血管侵犯侵袭转移有关[9,10].且有研究发现高腹膜转移潜能的胃癌细胞中miR-146a-5p也下调表达[11].说明miR-146a-5p可能参与胃癌进展过程,但miR-146a-5p对胃癌细胞增殖,迁移侵袭的影响尚不清楚.本实验通过在线软件预测发现LINC00963与miR-146a-5p,miR-146a-5p与核因子类红细胞2相关因子1(nuclear factor erythroid 2-like 1,NFE2L1)均有结合位点.NFE2L1是CNC-bZIP转录因子家族的成员,研究发现其与癌症发展以及变性和代谢性疾病的发病机理有关[12].研究报道线粒体呼吸缺陷通过信号转导与转录激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3,STAT3)/NFE2L1/突触融合蛋白12(synaptic fusion protein 12,STX12)轴增强肝癌细胞的侵袭性[13].lncRNA SLCO4A1反义RNA1(SLCO4A1 antisense RNA1,SLCO4A1-AS1)通过调节miR-4701-5p/NFE2L1轴激活WNT途径,促进肺腺癌的细胞生长并诱导其耐药性[14].而NFE2L1对胃癌细胞的影响尚未可知.本实验旨在研究LINC00963对胃癌细胞增殖,迁移侵袭的影响及机制是否与miR-146a-5p、NFE2L1有关.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料:选取本院病理科存档且已确诊为胃癌的组织标本42例,并选取其相应的癌旁组织,所有患者均知情且同意.纳入标准:经病理证实为胃癌患者;术前未接受抗肿瘤治疗者;排除标准:术前接受放疗或化疗等抗肿瘤治疗者;患有其他脏器重大疾病者.男性27例,女性15例,年龄在40-73岁之间,中位年龄63岁.淋巴结转移:转移18例,未转移24例;TNM分期:Ⅰ期15例,Ⅱ期13例,Ⅲ期14例.

1.1.2 细胞与主要试剂:永生化的人胃粘膜上皮细胞系GES1,胃癌细胞系SNU-1、AGS、HS-746T购自上海冠导生物工程有限公司.RPMI-1640培养基(美国Gibco);Trizol试剂、SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(日本Takara);总蛋白提取试剂盒(美国Invent);NFE2L1、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、MMP9抗体(英国biorbyt公司);细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)(日本同仁研究所);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国AAT Bioquest);Transwell小室、Matrigel(美国BD).

1.1.3 细胞培养与分组:GES1及SNU-1、AGS、HS-746T细胞均用RPMI-1640培养基培养,取对数生长期细胞SNU-1,将LINC00963、NFE2L1的干扰表达载体及其阴性对照,miR-146a-5p的模拟物及阴性对照转染至SNU-1细胞中,记为si-LINC00963组、si-NFE2L1组、si-NC组、miR-146a-5p组、miR-NC组,正常培养的SNU-1细胞作为NC组;将LINC00963干扰表达载体分别与NFE2L1的过表达载体及阴性对照转染至SNU-1细胞中,记为si-LINC00963+pcDNA-NC组、si-LINC00963+pcDNANFE2L1组.

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LINC00963、miR-146a-5p和NFE2L1 mRNA的表达水平:取适量胃癌组织、癌旁组织,研磨粉碎后加入Trizol试剂提取总RNA;收集GES1及SNU-1、AGS、HS-746T细胞及各组SNU-1细胞,直接加入Trizol试剂提取细胞总RNA;合成互补DNA(complementary DNA,cDNA),用SYBR Premix ExTaqTM试剂盒进行荧光定量PCR,以β-actin和U6为内参,用2-△△Ct法计算相对表达量.

1.2.2 Western blot法检测蛋白表达:提取细胞总蛋白,定量后取适量变性蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至聚偏二氟乙烯膜,用5%脱脂奶粉封闭1 h,加入一抗(1:800)4 ℃孵育过夜,加入二抗(1:1200)室温孵育2 h,用ECL发光液显影,成像后检测蛋白条带灰度值,蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/β-actin条带灰度值.

1.2.3 双荧光素酶报告实验:Starbase预测到LINC00963与miR-146a-5p、miR-146a-5p与NFE2L1-3’非翻译区(untranslated regions,UTR)存在结合位点.根据预测结果构建LINC00963及NFE2L1-3’UTR的野生型和突变型荧光素酶载体,将其分别与miR-NC和miR-146a-5p共转染至SNU-1细胞中,转染48 h收集细胞按照说明书检测荧光素酶活性.

将pcDNA-NC、pcDNA-LINC00963、si-NC、si-LINC00963转染至SNU-1细胞中,按1.4中方法检测miR-146a-5p表达水平.将miR-NC、miR-146a-5p、antimiR-NC、anti-miR-146a-5p转染至SNU-1细胞中;miR-146a-5p分别与pcDNA-NC、pcDNA-LINC00963共转染至SNU-1细胞中,anti-miR-146a-5p分别与si-NC、si-LINC00963共转染至SNU-1细胞中,按1.5中方法检测NFE2L1蛋白表达水平.

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖活性:各组细胞培养48 h后每孔加入10 μL的CCK-8试剂,孵育2 h后用酶标仪检测490 nm处吸光度值(absorbance,A),以A值代表细胞活性.

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭:细胞迁移实验:将细胞用无血清培养基重悬,取100 μL细胞悬浮液添加到Transwell上室,下室加600 μL含血清的培养基,培养48 h,用棉签除去膜顶表面上未迁移的细胞,膜下表面的细胞用多聚甲醛固定,清洗后用结晶紫染色,清洗、干燥;倒置显微镜下计数细胞.细胞侵袭实验:按照1:8比例用无血清培养基稀释Matrigel,包被Transwell小室底部膜的上室面,放入37 ℃培养箱孵育4 h使Matrigel聚合成胶备用.其余步骤和迁移实验一致.

统计学处理用SPSS 20.0软件进行统计学分析,符合正态分布的计量资料用平均数±标准差(mean±SD)表示,两组比较行t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 在胃癌患者癌组织中LINC00963表达上调 胃癌组织中LINC00963表达水平(3.76±0.24vs1.00±0.13,t=65.532,P<0.05)、NFE2L1 mRNA表达水平(2.16±0.25vs1.00±0.12,t=27.109,P<0.05)、NFE2L1蛋白表达水平(0.87±0.09vs0.42±0.05,t=28.326,P<0.05)高于癌旁组织;胃癌组织中miR-146a-5p表达水平(0.37±0.07vs1.00±0.18,t=21.140,P<0.05)低于癌旁组织.见图1.

图1 Western Blot检测NFE2L1蛋白表达. NFE2L1:核因子类红细胞2相关因子1.

2.2 在胃癌细胞系中LINC00963表达上调,miR-146a-5p表达下调,NFE2L1上调 与GES1细胞比较,胃癌细胞系SNU-1、AGS、HS-746T中LINC00963表达水平升高,miR-146a-5p表达水平降低,NFE2L1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)(图2,表1).

表1 在胃癌细胞系中LINC00963、miR-146a-5p和NFE2L1的表达(mean±SD,n=9)

2.3 LINC00963通过miR-146a-5p调控NFE2L1的表达 Starbase预测显示,LINC00963与miR-146a-5p存在结合位点(图3A),NFE2L1与miR-146a-5p存在结合位点(图2B);双荧光素酶实验结果显示,miR-146a-5p与LINC00963、NFE2L1的野生型报告质粒共转染的SNU-1细胞荧光素酶活性降低,而与LINC00963、NFE2L1的突变型报告质粒共转染的SNU-1细胞荧光素酶活性无显著变化(表2,表3);过表达LINC00963后miR-146a-5p表达水平降低;抑制LINC00963表达后miR-146a-5p表达水平升高(P<0.05)(表4);过表达miR-146a-5p后NFE2L1蛋白表达水平降低;抑制miR-146a-5p表达后NFE2L1蛋白表达水平升高(P<0.05)(图3C);同时过表达miR-146a-5p和LINC00963后NFE2L1蛋白表达水平升高;而同时抑制miR-146a-5p和LINC00963表达后NFE2L1蛋白表达水平降低(P<0.05)(图3D).

表2 miR-NC或miR-146a-5p与LINC00963野生型及突变型报告质粒共转染SNU-1细胞后相对双荧光素酶活性检测(mean±SD,n=9)

图2 Western Blot检测NFE2L1蛋白表达.NFE2L1:核因子类红细胞2相关因子1;β-actin:β肌动蛋白.

图3 LINC00963、miR-146a-5p、NFE2L1三者之间的靶向调控关系.A:Starbase对miR-146a-5p和LINC00963结合进行预测示意图;B:Starbase对NFE2L1和miR-146a-5p结合进行预测示意图;C:Western Blot检测NFE2L1蛋白表达;D:LINC00963通过miR-146a-5p调控NFE2L1的表达.LINC00963:长基因间非编码RNA 00963;miR-146a-5p:微小RNA-146a-5p;NFE2L1:核因子类红细胞2相关因子1.

表3 miR-NC或miR-146a-5p与NFE2L1-3’UTR野生型及突变型报告质粒共转染SNU-1细胞后相对双荧光素酶活性检测(mean±SD,n=9)

表4 qRT-PCR检测miR-146a-5p的表达(mean±SD,n=9)

2.4 低表达LINC00963抑制胃癌细胞SNU-1增殖,迁移和侵袭 与si-NC组比较,si-LINC00963组胃癌细胞SNU-1中LINC00963表达水平降低,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平降低,细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05)(图4,表5).

图4 低表达LINC00963抑制胃癌细胞SNU-1增殖,迁移和侵袭.A:Transwell检测细胞迁移和侵袭;B:Western Blot检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达.LINC00963:长基因间非编码RNA 00963;CyclinD1:细胞周期素D1;MMP2:基质金属蛋白酶2;MMP9:基质金属蛋白酶9.

表5 低表达LINC00963抑制胃癌细胞SNU-1增殖(mean±SD,n=9)

2.5 高表达miR-146a-5p抑制胃癌细胞SNU-1增殖,迁移和侵袭 与miR-NC组比较,miR-146a-5p组细胞活性及相关蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9的表达水平降低,细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05)(图5,表6).

图5 高表达miR-146a-5p抑制胃癌细胞SNU-1增殖,迁移和侵袭.A:Transwell检测细胞迁移和侵袭;B:Western Blot检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达.miR-146a-5p:微小RNA-146a-5p;CyclinD1:细胞周期素D1;MMP2:基质金属蛋白酶2;MMP9:基质金属蛋白酶9.

表6 高表达miR-146a-5p抑制胃癌细胞SNU-1增殖(mean±SD,n=9)

2.6 低表达NFE2L1抑制胃癌细胞SNU-1增殖,迁移和侵袭 与si-NC组比较,si-NFE2L1组NFE2L1表达按水平降低,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平降低,细胞活性降低,细胞迁移和侵袭数量减少(P<0.05)(图6,表7).

图6 低表达NFE2L1抑制胃癌细胞SNU-1增殖,迁移和侵袭.A:Transwell检测细胞迁移和侵袭;B:Western Blot检测NFE2L1、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达.NFE2L1:核因子类红细胞2相关因子1;CyclinD1:细胞周期素D1;MMP2:基质金属蛋白酶2;MMP9:基质金属蛋白酶9.

表7 低表达NFE2L1抑制胃癌细胞SNU-1增殖(mean±SD,n=9)

2.7 高表达NFE2L1可以逆转LINC00963低表达对SNU-1增殖,迁移和侵袭的抑制作用 与si-LINC00963+pcDNANC组比较,si-LINC00963+pcDNA-NFE2L1组NFE2L1表达水平升高,细胞活性以及增殖、迁移相关蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9的表达水平升高,且迁移和侵袭细胞数量增加(P<0.05)(图7,表8).

图7 高表达NFE2L1可以逆转LINC00963低表达对SNU-1增殖,迁移和侵袭的抑制作用.A:Transwell检测细胞迁移和侵袭;B:Western Blot检测NFE2L1、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达.NFE2L1:核因子类红细胞2相关因子1;LINC00963:长基因间非编码RNA 00963;CyclinD1:细胞周期素D1;MMP2:基质金属蛋白酶2;MMP9:基质金属蛋白酶9.

表8 高表达NFE2L1可以逆转LINC00963低表达对SNU-1增殖的影响(mean±SD,n=9)

3 讨论

胃癌是全球高发肿瘤,研究胃癌的发生及进展机制,开发相应的靶向药物应用于临床是目前靶向治疗的关键[15].研究报道LINC00963在骨肉瘤样品和细胞中高表达,LINC00963通过抑制miR-204-3p/纤维连接蛋白1(fibronectin 1,FN1)轴促进骨肉瘤的增殖和侵袭[16].LINC00963通过调节miR-506/支链氨基转移酶1(branched-chain amino acid transaminase 1,BCAT1)轴促进了神经胶质瘤细胞增殖,细胞周期进程,迁移和体外侵袭以及体内肿瘤发生[17].LINC00963通过miR-124-3p/卷曲蛋白4(frizzled-4,FZD4)途径促进结直肠癌的增殖和迁移[18].以上研究表明LINC00963在多种肿瘤中起促癌作用.本实验结果显示,LINC00963在胃癌组织和细胞系中高表达,提示LINC00963可能在胃癌中也起促癌作用.抑制LINC00963表达后,细胞活性降低,迁移和侵袭数量减少;说明抑制LINC00963表达可抑制胃癌细胞SNU-1增殖、迁移和侵袭.

研究表明miR-146a-5p可用作非侵入性生物标志物和多种癌症的靶向治疗药物[19].miR-146a-5p通过靶向下调白介素1受体相关激酶1(interleukin-1 receptorassociated kinase 1,IRAK1)的表达可抑制乳腺癌细胞的生长、迁移和侵袭[20].miR-146a-5p通过调节性别决定区Y框蛋白5(sex determining region Ybox protein 5,SOX5)抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和转移[21].本实验结果显示,胃癌细胞系中miR-146a-5p表达水平降低;与文献[9,10]中结果一致.为进一步研究miR-146a-5p对胃癌细胞的影响,本实验高表达miR-146a-5p,结果发现高表达miR-146a-5p可抑制胃癌细胞SNU-1的增殖、迁移和侵袭.研究报道LncRNA钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录本(KCNQ1oppositestrand/ antisensetranscript1,KCNQ1OT1)通过miR-146a-5p抑制放射敏感性并促进肝细胞癌的发生[22].本实验通过在线软件预测LINC00963可能靶向结合的miRNA,结果发现LINC00963可靶向结合miR-146a-5p;且本实验证实了LINC00963靶向调控miR-146a-5p,说明LINC00963可能通过调控miR-146a-5p影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等过程.

本实验通过在线软件预测发现miR-146a-5p与NFE2L1有结合位点;研究报道NFE2L1在食管鳞癌中高表达,与食管鳞癌肿瘤分化程度和淋巴转移相关[23].肺泡Ⅱ型上皮细胞中NFE2L1在乌拉坦所致的小鼠肺腺癌中发挥肿瘤抑制作用[24].本实验结果显示,胃癌细胞系中NFE2L1 mRNA和蛋白表达水平升高.抑制NFE2L1表达可降低细胞活性降低,减少迁移和侵袭数量;表明NFE2L1低表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭.且本实验表明miR-146a-5p靶向调控NFE2L1;还发现LINC00963通过miR-146a-5p调控NFE2L1的表达,高表达NFE2L1逆转了LINC00963低表达对SNU-1增殖,迁移和侵袭的抑制作用.

4 结论

综上所述,LINC00963低表达可能通过调控miR-146a-5p/NFE2L1轴抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭.

文章亮点

实验背景

胃癌是全球常见癌症,死亡率高,但胃癌发生、进展的潜在机制尚未阐明,已有报道显示lncRNA表达异常可调控胃癌细胞恶性生物学行为,但仍有部分lncRNA在胃癌进展中作用机制尚未可知.

实验动机

LINC00963在胃癌中表达上调,但LINC00963在胃癌进展中的作用机制并不清楚.既往研究证实LINC00963在肿瘤进展中具有致癌作用.因此,探讨LINC00963在胃癌进展中的作用和机制对胃癌诊断和治疗意义重大.

实验目标

LINC00963低表达通过调控miR-146a-5p/NFE2L1轴可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,为胃癌治疗提供潜在靶点.

实验方法

RT-qPCR和western blot检测胃癌组织、细胞系中LINC00963、miR-146a-5p和NFE2L1的表达.将si-LINC00963、si-NFE2L1、miR-146a-5p mimics分别转染到胃癌细胞SNU-1中,CCK-8法检测细胞增殖;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告实验验证LINC00963与miR-146a-5p、miR-146a-5p与NFE2L1的靶向关系.将si-LINC00963和pcDNA-NFE2L1共转染到SNU-1细胞中,采用CCK-8、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力.Western blot检测增殖、迁移和侵袭相关蛋白表达.

实验结果

LINC00963、NFE2L1在胃癌组织、细胞系中表达上调,miR-146a-5p表达下调.低表达LINC00963或低表达NFE2L1或高表达miR-146a-5p均可抑制SNU-1细胞增殖、迁移和侵袭,下调CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达.双荧光素酶报告实验证实LINC00963可靶向结合miR-146a-5p,miR-146a-5p可靶向结合NFE2L1.LINC00963可负向调控miR-146a-5p表达,miR-146a-5p可负向调控NFE2L1表达.高表达NFE2L1可以逆转LINC00963低表达对SNU-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用.

实验结论

胃癌中LINC00963表达增加,LINC00963低表达通过调控miR-146a-5p/NFE2L1轴能够减弱胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力.

展望前景

LINC00963下游是否存在其他miRNA、miR-146a-5p下游是否存在其他靶点仍需进一步确认,还需体内移植瘤实验验证LINC00963的致癌作用,LINC00963/miR-146a-5p/NFE2L1轴可能作为胃癌治疗的靶标基因.