股骨头和血清LncRNA HOTAIR表达与非创伤性股骨头坏死进展的相关性

刘伟乐，郑少伟，黎 旭，王 胤，孙春汉，谢福杰，钟浩博

1惠州市第一人民医院骨科，广东 惠州 516000；2广东医科大学，广东 湛江 524023

股骨头坏死（ONFH）是一种由凝血、纤溶系统紊乱和血液供应不足引起的骨质破坏性疾病，通常会导致进行性股骨头塌陷和继发性关节炎，需要进行保髋手术，或更严重者需全髋关节置换术［1］。ONFH可分为创伤型和非创伤型。作为ONFH的一个亚型，非创伤性ONFH常发生在皮质类固醇治疗炎症性疾病以及滥用酒精等情况之后［2］。据报道，非创伤性ONFH的发生和发展与多种因素密切相关，包括人类免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、酗酒、使用糖皮质激素和凝血障碍［3］。但迄今为止该病的发病机制尚未完全清楚。

非编码RNA是编码人类基因组蛋白质产物的信使RNA（mRNA）转录出的大量没有蛋白质编码能力的RNA［4］。近年来发现的长链非编码RNA（LncRNA）是一类由200个以上核苷酸组成的非编码RNA亚群，在正常人体生理和病理过程中起到了重要作用［4］。近年来发现一些LncRNA在ONFH病理过程中发挥了重要的调控作用，如HOX转录反义RNA（HOTAIR）是一个最早于2007年发现的LncRNA，已被证明与多种癌症、心血管疾病以及帕金森病的等进展密切相关［5-7］。但目前为止还未有研究探讨HOTAIR在与非创伤性ONFH进展的相关性。本研究拟测定股骨头局部以及血清HOTAIR表达，探讨其是否与非创伤性疾病严重程度呈正相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018 年1 月～2020 年1 月我院收治的90 例ONFH患者。所有患者均接受全髋关节置换或保髋手术(包括髓核减压术、带血管骨移植、股内翻截骨术和股骨旋转截骨术)治疗。ONFH的诊断、分类和分期参考2001年日本骨科协会制定的标准［8］。纳入标准：根据X线、MRI和CT扫描诊断为ONFH；激素性ONFH患者在1年内平均服用16.6 mg/d或等效最大剂量80 mg/d泼尼松龙；酒精相关性ONFH患者的酒精摄入量大于400 mL/周（320 g/周），持续6月以上。排除标准：不符合激素性或酒精性ONFH诊断标准；排除外伤性ONFH、髋关节脱位或其他髋关节疾病；有Paget病、肾性骨营养不良、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退或骨转移病史。同时，选取84名年龄和性别分布相似的在我院进行健康体检人群作为对照组，排除ONFH 患者和其它疾病。ONFH组患者男50例，女40例，年龄30～67岁（48.3±7.9岁），病程1～12.5年（5.8±2.1年）；对照组男46例，女38例，年龄27～70岁（49.1±6.6岁）。所有参与者都签署了知情同意书，本研究获我院伦理委员会批准。

1.2 组织和血清样本检测

在进行手术前，从患者身上采集静脉血样本（空腹状态）。采血后4 h内处理所有血清标本。1500 g离心15 min后分离得到血清。从患者中获得90例坏死组织和邻近的非坏死组织。根据试剂盒说明，使用带有gDNA的PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）将总RNA反向转录到cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche，Basel，Germany）进 行qRTPCR。将数据标准化为GAPDH的表达，并用2-△△Ct法分析各基因的相对表达水平。所有实验重复3次。本研究中使用的引物序列如下：HOTAIR：正向：5'-AGCCCTAGCCTTTGGAAGCT-3'；反向：5'-ACCCAT GTGTCTCAAGATGCATT-3'；GAPDH：正向：5'-ACCA CAGTCCATGCCATCAC-3'；反向：5'-TCCACCACCCT GTTGCTGTA-3'。

1.3 影像学进展分级

应用国际骨循环研究学会（ARCO）分类系统对ONFH患者的影像学进展进行研究，ARCO分级依靠多种影像学手段对ONFH坏死的严重程度进行评判，具体分为5个阶段（0～4级）。0级：X射线、CT或MRI上没有任何变化；1级：X射线和CT未发现异常，但MRI扫描均为异常；2级：早期的X线改变，出现硬化等，但未见到新月征，软骨下骨的完整性尚未受到损害；3级：有早期骨折（新月征）和股骨头变平的影像学证据；4级：关节间隙变窄和破坏，表明骨关节炎存在［9］。

1.4 症状严重程度评估

采用视觉模拟量表（VAS）和Harris髋关节评分确定ONFH的症状严重程度。VAS评分用于评估疼痛程度，其范围从0到10，0表示完全没有疼痛，10表示极度疼痛［10］。Harris髋关节评分是一种基于临床医生的工具，用于测量全髋关节置换术后的结果，也常用于评估包括ONFH在内的髋关节相关疾病的功能能力［11］。

1.5 统计学分析

采用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。定量数据以均数±标准差或中位数（四分位数间距）表示，以Kolmogorov-Smirnov检验数据正态分布。采用单因素方差分析比较不同ARCO分级患者的HOTAIR水平，Bartlett 检验用于检验组间方差的均一性，随后进行Tukey或Tahmane事后检验，应用Pearson或Spearman分析HOTAIR水平与疾病严重程度之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 ARCO分期1～4期X线股骨头坏死改变Fig.1 X-ray changes of ONFH in ARCO stage 1-4.

2 结果

2.1 患者临床资料

90例ONFH患者中包括激素型ONFH 48例，酒精型ONFH 42例。激素型ONFH和酒精型ONFH患者血清和局部HOTAIR表达差异无统计学意义（P>0.05，图2A），ONFH患者血清HOTAIR相对表达高于正常对照组（1.97±0.32vs1.00±0.10，P<0.001，图2B)，此外坏死组织HOTAIR相对表达显著高于非坏死组织中的表达(2.37±0.25vs1.00±0.10，P<0.001，图2C）。

图2 HOTAIR在ONFH患者中的表达水平Fig.2 HOTAIR expressions in ONFH patients.

2.2 血清和局部HOTAIR表达与ARCO分级的关系

90例不同程度的非创伤性ONFH患者的血清和局部HOTAIR表达情况（表2）。据此，根据ARCO分级系统将ONFH患者分为3组。ONFH组30例为ARCO 1/2级，30例为ARCO 3级，30例为ARCO 4级。ARCO 4级的ONFH 患者血清HOTAIR 表达高于3 级（2.22±0.28vs1.94±0.36，P=0.001，图3A）。ARCO 3 级的ONFH患者与ARCO 1/2级相比，血清HOTAIR表达升高（1.94 ± 0.36vs1.73 ± 0.23，P=0.009，图3A）。Spearman 相关分析显示，血清中HOTAIR 的表达与ARCO分级呈显著正相关（r=0.569，P<0.001，图3C）。

另一方面，ARCO 4 级的ONFH 患者的局部HOTAIR表达明显高于3级ARCO患者（2.58±0.22vs2.42±0.32，P=0.020，图2B）。ARCO3级的ONFH患者与1/2 级患者相比，HOTAIR 的局部表达显著升高（2.42±0.32vs2.13±0.24，P<0.001，图3B）。Spearman相关分析显示，局部HOTAIR表达与ARCO分级呈显著正相关（r=0.585，P<0.001，图3D）。

图3 血清与局部HOTAIR在不同ARCO分期时期的表达程度Fig.3 Serum and local HOTAIR expressions among different ACRO stages.

2.3 血清和局部HOTAIR表达与临床严重程度的关系

血清和局部HOTAIR表达与VAS和HSS评分确定的临床严重程度的相关性分析显示，血清和局部HOTAIR表达与VAS评分呈正相关（血清r=0.557，P<0.001；局部r=0.672，P<0.001，图4A、C），血清和局部HOTAIR的表达与HSS评分呈负相关（血清r=-0.326，P=0.002；局部r=-0.489，P<0.001，图4B、D）。

图4 ONFH患者血清与局部HOTAIR表达与临床症状严重的相关性Fig.4 Correlation of serum and local HOTAIR expressions with clinical severity in ONFH patients.

2.4 ROC曲线分析

在ARCO 1/2vsARCO 3 期，AUC=0.663（P=0.03，图5A）；ARCO 3vsARCO 4期，AUC=0.726（P=0.003，图5B）。

图5 血清HOTAIR水平的ROC曲线分析Fig.5 A ROC curve analysis of HOTAIR expressions.

3 讨论

本研究首次探讨了股骨头和血清LncRNA HOTAIR表达与非创伤性股骨头坏死进展的相关性。结果发现非创伤性ONFH患者血清HOTAIR表达显著高于健康对照组，ONFH组织中的局部HOTAIR在坏死区明显高于非坏死区。与ARCO 1/2级相比，ARCO 3级血清和局部HOTAIR表达显著升高；与ARCO 3级相比，ARCO 4级的血清和局部HOTAIR表达显著升高。血清和局部HOTAIR表达与ARCO分级呈正相关性，与VAS评分呈显著正相关，与Harris髋关节评分呈负相关。进一步ROC曲线分析表明，血清HOTAIR可作为诊断非创伤性ONFH影像学进展的良好指标，表明非创伤性ONFH患者血清和局部HOTAIR表达升高可能反映ONFH病情的严重程度。

到目前为止，非外伤性ONFH大多是根据影像学表现以及疼痛和功能受损的主诉来诊断的［12］。然而，影像学改变包括囊性或硬化性改变、软骨下塌陷和关节间隙狭窄几乎是中晚期的征象［13］。此外，还有目前临床上还没有明确的手段来监测非创伤性ONFH的进展及手术或药物治疗的疗效，因此迫切需要更有效、可靠、定量的方法来监测早期非创伤性ONFH 的进展及治疗效果。生物标志物是预测疾病预后和评价治疗效果的有效工具，近年来新型可靠的生物标志物的应用得到了广泛的应用。对于非创伤性ONFH，血清生物标记物分析可作为临床相关方法，在X线显示骨坏死迹象之前监测ONFH的进展［14］。

LncRNA是另一种可以作为疾病诊断标记物循环标志物的RNA分子，其长度大于200 bp的转录物，没有或几乎没有翻译潜能。它们在表观遗传学、转录和转录后水平上沉默或增强近端基因的表达［15］。本研究发现LncRNA HOTAIR在非创伤性ONFH患者中表达升高，表明其在该病中具有重要的作用进展。骨代谢紊乱和供血不足是ONFH的关键步骤。HOTAIR 在前期的一项芯片分析中发现，激素型ONFH组的HOTAIR表达水平显著高于正常对照组［16］；另一研究发现HOTAIR可靶向miR-17-5p抑制非创伤性调节ONFH成骨分化和增殖［17］。HOTAIR通过抑制VEGFA的表达抑制人胎盘血管生成［18］，也下调miR-126/SCEL通路促进烧伤创面血管生成［19］，而通过抑制HOTAIR的组蛋白修饰可以抑制激素性ONFH的进展［20］。上述研究结合本研究表明HOTAIR可以抑制血管生成，抑制成骨，可能在非创伤性ONFH的进展中起到了重要作用。

本研究仍然有一些局限性。首先，本研究没有包括对生物学功能的深入分析，这对于阐明HOTAIR在非创伤性ONFH中的作用至关重要。其次，本研究是一项横断面研究，样本量相对较小，可能会影响目前的研究结果。尽管我们获得了HOTAIR与ONFH疾病进展之间的关联的证据，但非创伤性ONFH的发病机制仍不完全清楚。

综上，本研究首次报道了非创伤性ONFH患者中HOTAIR的异常表达，非创伤性ONFH患者血清和局部HOTAIR表达升高与疾病严重程度相关，这也为认识本病的发病机制、早期诊断和指导治疗提供了新的思路。