影像学联合三种分子诊断技术诊断结核病的价值

曹楠楠，钟艺绮，司徒博，何永建

1广东省中医院检验科，广东 广州 510120；2南方医科大学南方医院检验医学科，广东 广州 510515

研究报道约85%的结核病(TB)患者可以通过服用6月的药物方案成功治疗［1］。尽早诊断结核病对于结核病防治尤其重要。影像学检查是常规筛查结核病的主要手段，主要包括胸部X线检查和核磁共振检查等。但由于结核病多无特异性影像学表现，影像学检查必须结合TB病原学检查才可确诊结核病。随着分子生物学诊断技术的不断发展，建立在核酸扩增基础上的TB检测技术已被世界卫生组织所认可。2010年12月，世界卫生组织推荐GeneXpert MTB/RIF方法检测TB rpoB基因和突变，快速诊断结核病及检测利福平耐药性［2］；另外两种核酸检测方法包括TaqMan探针荧光定量PCR法［3］和恒温扩增法［4］也在全球TB诊断中得到广泛应用。

既往研究多聚焦在将分子生物学方法与传统的涂片和培养方法进行对比，评估其敏感度和特异性。但目前尚无3种不同原理的分子生物学TB检测方法的比较研究。在临床检验工作中，这3种方法都是WHO推荐的常用方法，但敏感度和特异性比较尚无相关数据。本文旨在比较基于TB核酸检测的3种常用分子生物学方法：Xpert TB/RIF、TaqMan 探针荧光定量PCR 法和RNA恒温扩增检测TB性能，探讨其结合影像学表现诊断结核病的价值。

1 资料与方法

1.1 标本来源

选取南方医科大学南方医院2019年2～4月影像学检查怀疑存在感染性病灶的患者体液标本38例，所有标本均被送至检验科进行病原学检测。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒（半巢式实时定量PCR法）（Cepheid），结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒（TaqMan探针法）（深圳凯杰公司），结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）（上海仁度），抗酸染色试剂（珠海贝索）。

1.2.2 仪器 GeneXpert MTB/RIF检测系统、荧光定量PCR仪cobas z 480、台式高速离心机、恒温金属浴锅、Heal Force生物安全柜、Effendorf离心管、Effendorf加样枪、Effendorf吸头。

1.3 方法

1.3.1 标本收集及前处理 收集临床标本，先取2 mL进行涂片镜检，然后对标本进行前处理：取4 mL标本加入有螺旋盖的50 mL离心管中，按体积比2∶1加入样品处理试剂，用力振摇10～20次后，在室温下静置15 min。对液化后的标本分别进行GeneXpert MTB/RIF、荧光探针PCR和RNA恒温扩增检测。

1.3.2 GeneXpert MTB/RIF检测TB 取2 mL液化处理后样品缓慢加入检测匣中，将检测匣放入GeneXpert系统仪器检测模块中，并参阅GeneXpert Dx System操作手册，启动测试并自动化检测结果。

结果判断：基于样品中结核分枝杆菌的Ct值，结核分枝杆菌结果将以高（Ct<16）、中（1628）来表示。

1.3.3 TaqMan探针荧光定量PCR检测TB DNA提取：往1.5 mL无菌离心管中加入液化好的样本900 μL，然后使用高速离心机在13 000 r/min的转速离心2 min，弃去上清后加入200 μL核酸抽提液A液，振荡悬浮，静置3 min；加入250 μL核酸抽提液B液，13 000 r/min高速离心10 min，弃去上清后再次13 000 r/min 离心1 min。用加样枪把上清吸干，加入核酸抽提液C液180 μL，13 000 r/min的转速下离心5 min后吸去上清，60 ℃恒温加热干燥5 min，最后加入去RNA酶水40 μL，在13 000 r/min的转速离心1 min，DNA提取即完成。

扩增试剂准备：从试剂盒中取出TB PCR 反应液、Taq 酶以及UNG 酶，室温融化且振荡混匀后，2000 r/min离心10 s。在设定的每个PCR反应管中分别加入反应液与酶混合液的混合液38 μL（反应液37.8 μL＋酶混合液0.2 μL），并且在反应管中分别加入上一步骤提取过的样本、阴性对照和阳性对照各2 μL，盖紧管盖且2000 r/min的转速离心1 min。

PCR扩增：将PCR反应管放置入荧光定量PCR仪中。扩增程序如下：37 ℃5 min；93 ℃1 min；93 ℃热变性10 s，使DNA双链解离成为单链；60 ℃退火40 s，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；72 ℃延伸45 s，DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下合成一条新的链，共设40个循环。

1.3.4 RNA恒温扩增法检测TB RNA提取：取1 mL液化后标本于样品管中，盖紧管盖，13 000 r/min高速离心5 min后弃上清，然后加入1 mL生理盐水，重悬洗涤。再于13 000 r/min的转速下离心5 min，再次弃去上清并且吸入100 μL TB稀释液重悬；超声破碎15 min，功率为300 W，破碎后的样本13 000 r/min离心5 min。

仪器和试剂准备：取2 μL处理物加入含30 μL扩增检测液的洁净微量反应孔中，60 ℃预热10 min，42 ℃预热5 min；每孔悬空加入10 μL在42 ℃预热的SAT酶。

扩增检测：将微量反应管移至荧光检测仪器，立即启动反应程序，PCR反应程序为42 ℃1 min，40个循环，荧光通道设置为F1（FAM）荧光信号采集1次/min。

1.4 统计学分析

采用SPSS22.0对数据进行分析，采用行×列表的χ2检验对3种检测方法的检出率进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 怀疑为TB患者的胸部X线图像

根据肺结核诊断和治疗指南中描述的疑似肺结核患者的X线特点筛查患者。在2019年2～4月就诊患者中筛查出怀疑TB的患者38例。TB患者的胸部X线常无特征性改变，影像学可表现为：肺上叶尖后段或肺下叶背段或后基底段有异常；X线影像呈现渗出、增殖、纤维和干酪性病变、病变吸收慢等。

2.2 怀疑为TB患者的标本情况

以临床诊断为金标准，结果显示23例标本来自TB患者，15例来自临床排除TB患者。标本类型包括肺泡灌洗液25例，咳痰8例，胸水2例，腹水1例，穿刺液2例（表1）。

表1 38例标本情况Tab.1 Types of 38 specimens（n）

2.3 3种方法检测TB检出率

在本研究的38例标本中，GeneXpert MTB/RIF检测阳性20例，TaqMan探针荧光定量PCR检测阳性12例；RNA恒温扩增法检测阳性3例；涂片镜检法阳性2例。GeneXpert MTB/RIF检测的阳性率最高（52.6%，20/38），其次为TaqMan探针荧光定量PCR（31.6%，12/38）和RNA恒温扩增法（7.9%，3/38）。按照行×列表的χ2检验进行3种方法TB检出率的比较，3种方法的TB检出率差异有统计学意义（χ2=25.185，P<0.01，表2）。

表2 3种方法对TB感染检出率比较Tab.2 Comparison of the detection rate of TB infection by three methods（n）

图1 肺结核患者常见胸片图像Fig.1 Common chest X-ray images of pulmonary tuberculosis patients.

2.4 3种方法检测TB的敏感度和特异性

本研究发现GeneXpert MTB/RIF方法的敏感度和阴性预测值最高，其次为TaqMan探针荧光定量PCR，RNA恒温扩增法的敏感度和阴性预测值最低。3种方法的阳性预测值均为100%(表3)。

表3 GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探针荧光定量PCR及RNA恒温扩增性能比较Tab.3 Comparison of the results of GeneXpert MTB/RIF,TaqMan probe fluorescence quantitative PCR and RNA constant temperature amplification（%）

2.5 TB核酸含量对于3种方法敏感度的影响不一致

GeneXpert MTB/RIF方法对于较低含量的TB检出率高。GeneXpert MTB/RIF检测阳性20例中TB结果等级含量为中等6 例，低含量7 例，极低含量7 例；TAQMAN探针荧光定量PCR法检测的12例阳性标本中，所对应的GeneXpert MTB/RIF检测TB结果等级为中等6例，低含量4例，极低含量2例；RNA恒温扩增法检测阳性3例标本所对应的TB结果等级为中等2例，低含量1例。

3 讨论

结核分枝杆菌感染的诊断难度大、治疗周期长、药物副作用大，给人类战胜结核病带来巨大的挑战。对结核患者进行早期诊断，有助于合理用药、有效降低发病率、复发率及死亡率［5］。胸部X线检查是诊断肺结核的常用检查方法，但肺结核的胸部X线表现并无特征性改变，可呈多形态表现即同时呈现渗出、增殖、纤维和干酪性病变，可伴胸腔积液、胸膜增厚与粘连等［6］。对于肺外结核病，胸部X线表现可不明显。怀疑肺外结核病的患者除胸部X线检查外，则还需进行核磁共桭或CT检查，且不易与肿瘤、结节等其他疾病相区别［6］。因此对于影像学检查怀疑TB感染的患者，必须进行病原学检查以明确诊断［7］。

结核分枝杆菌病原学检验是临床确诊结核病的金标准［7］。传统的病原学检验方法包括直接涂片法和培养法。涂片法存在敏感度差和特异性差等缺点，而培养法则存在敏感度差和需时较长的不足，无法满足临床需求。结核分枝杆菌核酸分子生物学检测具有简便、快速、特异性高等特点，目前已经广泛应用于结核分枝杆菌感染快速检测［8］。

本文研究的3种结核分枝杆菌核酸检测方法是目前最常用的分子生物学方法［9-14］，原理和靶基因也不尽相同。GeneXpert MTB/RIF以半巢式实时定量PCR扩增技术为基础，能够自动抽提DNA并且扩增rpoB基因。由于95%以上的利福平耐药菌株都有rpoB基因变异，所以扩增rpoB基因同时可以鉴定是否为利福平耐药菌株。因大部分利福平耐药的菌株同时对异烟肼耐药，故rpoB基因的检测又可在一定程度上判断是否为多耐药菌株［9］。荧光探针PCR法采用TaqMan探针法［10］，根据结核分枝杆菌基因的保守序列设计引物，特异性较高。RNA恒温扩增法无需复杂的仪器即可扩增检测结核分枝杆菌复合群RNA，由于检测靶标为RNA，该方法能够检测活菌，可用于结核病治疗的疗效评估［11］。

已有的结核分枝杆菌感染检验研究多聚焦在将这些分子生物学方法分别与传统或改良的培养、涂片方法进行对比。有学者对质量不佳的咳痰标本进行培养和Xpert TB/RIF检测检验，Xpert TB/RIF方法检测TB的敏感度为24.2%，培养法为21.3%［12］，显示出分子生物学方法比传统的培养法具有更高的敏感度。但目前尚无将3种不同原理和靶标的分子生物学方法进行性能比较的研究，无法给临床选择合适的分子生物学检验方法提供数据参考。而本研究为此提供了重要的数据补充。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF、TaqMan探针荧光定量PCR法、RNA恒温扩增法检测TB的敏感度分别为87.0%、52.2%、13.0%。与其他两种方法相比，GeneXpert MTB/RIF对于结核分枝杆菌病原体检测具有较高的敏感度和特异性（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF对于低含量的结核分枝杆菌检出率也较高，主要原因可能在于Xpert TB/RIF检测试剂包含3对特异性引物和5个探针，检测rpoB gene并采用封闭性Xpert检测匣，整合并且自动完成样品纯化、核酸扩增、核酸特异序列检测、自动测定出结果等多个程序，DNA提取效率高，多靶标多引物扩增效率高。TaqMan探针荧光定量PCR采用结核分枝杆菌的保守序列设计探针，该方法的检测性能受探针序列影响大。探针序列的结合效率、保守程度和温度都可能影响该方法的检测效果；且在该方法提取临床标本中模板DNA的操作中多为人工操作，受影响因素增多，这些都可能造成TaqMan探针荧光定量PCR对结核分枝杆菌核酸的检测效率降低。RNA恒温扩增法以结核分枝杆菌RNA为模板，RNA易降解的特性对该方法的敏感度造成极大的降低。

在本研究中，GeneXpert MTB/RIF方法的敏感度为87.00%，特异性为100.00%，阴性预测值为83.30%。一项包含9500名患者的GeneXpert MTB/RIF方法学系统评价也显示GeneXpert MTB/RIF 具有高敏感度（89%）和高特异性（99%）［15］，结果与本文一致；但另一项包含568例肺结核患者的研究显示，GeneXpert MTB/RIF检测在肺结核患者中敏感度仅39.61%［16］；也有学者对质量不佳的咳痰标本进行的GeneXpert MTB/RIF检测研究显示敏感度仅为24.2%。敏感度差别巨大的原因可能在于本研究与Steingart 等［15］的研究中GeneXpert MTB/RIF的检测标本主要为肺泡灌洗液，而有研究标本为咳痰［16］，部分研究标本甚至为质量不佳的咳痰［12］。痰液中含有的其他体液物质具有抑制核酸扩增的作用，对于怀疑结核分枝杆菌感染的患者，应推荐采用肺泡灌洗液标本进行GeneXpert MTB/RIF 检测，以提高敏感度。同时由于本研究标本数量相对较少，且主要为肺泡灌洗液标本，GeneXpert MTB/RIF、荧光探针-PCR和RNA恒温扩增法对其他标本类型的检测性能无法评估，仍需收集更多的标本进行探索和研究。

有研究发现，仅表现为低热、消瘦、咳嗽等一般症状而无影像学表现的患者，GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的性能将大大降低［17］，因此影像学检查与分子生物学检查必须密切结合，才能够为临床提供快速筛选，确诊结核病。

综上所述，对影像学表现怀疑结核病的患者，推荐进行GeneXpert MTB/RIF检查。GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度明显高于PCR-荧光探针、RNA恒温扩增法，操作方法便捷，同时能快速检测利福平的耐药，在很大程度上预测多重耐药结核，为临床医生诊断结核或是耐药结核提供重要帮助。