灰霉病菌对4种常用杀菌剂的抗药性监测

周明洋

(南京市高淳区固城街道农业技术推广服务中心,江苏 南京 211300)

1.前言

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一种全球范围的真菌病害。灰葡萄孢可以侵染235种蔬菜、果树以及其他经济作物（李保聚，1998），一旦发病就会引起大量减产，甚至绝收，给农业生产造成重大危害(陈凤平等，2010)。灰葡萄孢的菌核可直接萌发产生菌丝体、分生孢子梗及分生孢子，分生孢子成熟后脱落，借气流、雨水或露珠及农事操作进行传播（李保聚等，1998）。在18~23℃和相对湿度持续90%以上的多湿、弱光条件下，农作物最易发病；温度低于15℃或高于25℃时，则发病明显减轻；温度高于30℃时，基本不发病。另外，在田间分生孢子可多次再侵染（Meyer，2008）。

灰霉病的防治一直是个重要问题，目前生产上主要通过物理防治、化学防治和生物防治等几种方法，其中最有效的方法为化学防治（张彩凤等，2013）。化学防治常用药剂主要有苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类和抗菌素类四大类。而由于灰霉病菌具有繁殖速度快、遗传变异大和适合度高等特点，连续长期使用单一药剂容易产生抗药性。目前，灰葡萄孢已对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类等药剂产生抗药性。其抗药性机理主要为毒剂渗透性减弱、脱毒作用增强与毒性代谢产物转换作用的减弱、靶标位点敏感性降低等（于永学等，2009）。由于灰霉病菌抗药性在生产上造成了一系列问题，因此，我们需要通过进一步的研究来深入了解灰霉病菌的抗药性。为明确不同地区不同作物上灰霉病菌的抗药性情况，本研究主要对采自苏州、南通、扬州、上海、嘉善、宁波等地的番茄、莴苣、草莓、瓠瓜、西瓜、黄瓜等不同作物上的153种灰霉菌菌株的抗药性进行了检测。

2.材料与方法

2.1 菌株的采集

2020 年，在苏州、扬州、南通、上海和浙江等地的塑料大棚内，采集番茄、莴苣、草莓、黄瓜、瓠瓜和西瓜等灰霉病病株，共分离得灰霉菌株153个（表1）。

表1 分离自不同地区的灰霉菌株

2.2 供试药剂

多菌灵：95% 多菌灵原药；速克灵：98% 速克灵原药；

嘧霉胺：98% 嘧霉胺原药；咯菌腈：97.1% 咯菌腈原药。

2.3 培养基

PDA：马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤。继续加热，再加入15～20g琼脂，搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入10 g葡萄糖。搅拌均匀，稍冷却后再加水定容至1000mL。分装于锥形瓶中，加塞、包扎，121℃，灭菌20 min后取出，冷却后贮藏备用。

LSP：10 g Glucose，1.5 g K2HPO4，2.0 g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，0.5 g MgSO4•7H2O，16 g Agar，1000 ml H2O。

2.4 含药平板的制备

95%多菌灵原药用0.1 mol/L HCL水溶液配制成1000 μg/mL 母液；98%速克灵原药用丙酮配置成10000 μg/mL 母液；98%嘧霉胺原药用甲醇配制成1000 μg/mL 母液；97.1% 的咯菌腈原药用甲醇配制成1000 μg/mL 母液。各母液在4 ℃冰箱内贮藏，使用时将多菌灵、速克灵和咯菌腈分别配制成1μg/mL、5μg/mL和0.5μg/mL 的含药PDA平板；将嘧霉胺配制成1μg/mL 的含药LSP平板，然后用以进行抗药性测定。

2.5 抗药性监测

采用区分剂量法。将在1μg/mL多菌灵含药平板、5μg/mL速克灵、0.5μg/mL咯菌腈和1μg/mL的嘧霉胺含药平板上不能正常生长的菌株定义为敏感菌株，能在平板上生长的菌株定义为抗性菌株。将待测菌株在PDA平板上25 ℃培养96 h 后，将带菌平板切成小块，然后用接种针将其接于含药平板上。25 ℃黑暗培养72 h 后，观察菌丝生长情况，统计各地区敏感和抗性菌株的频率，每处理重复3次。

抗性频率(%)=(抗性菌株数／测定总菌株数)×100%。

3.结果与分析

3.1 不同地区来源灰霉病菌对几种药剂的抗性频率

由表2可知，供试的153个菌株中，对嘧霉胺表现抗性的菌株有98个，占总数的64.05%。可以看出，在扬州和南通地区，灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率在50%以下，而其它地区抗性频率均较高，特别是在上海地区，高达97.61%。因此，在上海、嘉善等地区，嘧霉胺已不再适宜用于蔬菜灰霉病的防治。

表2 不同地区来源菌株对嘧霉胺的抗性频率

平均 98 153 64.05

由表3可知，供试153个菌株中，对多菌灵表现抗性的菌株有104个，抗性频率为67.97%。可以看出，灰霉病菌对多菌灵的抗性频率均较高，但扬州地区仅为8.33%，说明多菌灵在扬州地区仍可作为防治蔬菜灰霉病的主要药剂。

表3 不同地区来源菌株对多菌灵的抗性频率

由表4可知，供试153个菌株中，对速克灵表现抗性的菌株有98个，抗性频率为64.05%。可以看出，在扬州和南通地区，灰霉病菌对速克灵的抗性频率在50%以下，而其它地区抗性频率均较高，特别是在上海地区，高达95.23%。因此，在上海、嘉善等地区，速克灵已不再适宜用于蔬菜灰霉病的防治。

表4 不同地区来源菌株对速克灵的抗性频率

由表5可知，所有供试的153个菌株均对咯菌腈敏感，未能检测到抗性菌株，因此，咯菌腈可认为是目前生产上各地防治灰霉病的首选药剂。

表5 不同地区来源菌株对咯菌腈的抗性频率

3.2 不同寄主来源灰霉病菌对几种药剂的抗性频率

由表6可知，供试153个菌株中，对嘧霉胺表现抗性的菌株有98个，抗性频率为64.05%。可以看出，来源于西瓜和莴苣的灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率较低，而其它来源菌株抗性频率较高，特别是源自瓠瓜和黄瓜的灰霉菌株全部对嘧霉胺表现抗性，这可能是因为在西瓜和莴苣上嘧霉胺使用较少，而在瓠瓜和黄瓜上施用较多的缘故。

表6 不同寄主来源菌株对嘧霉胺的抗性频率

由表7可知，供试153个菌株中，对多菌灵表现抗性的菌株有104个，抗性频率为67.97%。可以看出，来源于西瓜和莴苣的灰霉病菌对多菌灵的抗性频率为0，而其他来源菌株抗性频率较高，特别是源自瓠瓜和黄瓜的灰霉菌株全部对多菌灵表现抗性，这可能是因为在西瓜和莴苣上多菌灵使用较少，而在瓠瓜和黄瓜上施用较多的缘故。

表7 不同寄主来源菌株对多菌灵的抗性频率

由表8可知，供试153个菌株中，对速克灵表现抗性的菌株有98个，抗性频率为64.05%。可以看出，来源于西瓜和莴苣的灰霉病菌对速克灵的抗性频率为0，而其他来源菌株抗性频率较高，特别是源自瓠瓜和黄瓜的灰霉菌株全部对速克灵表现抗性，这可能是因为在西瓜和莴苣上多菌灵使用较少，而在瓠瓜和黄瓜上施用较多的缘故。

表8 不同寄主来源菌株对速克灵的抗性频率

黄瓜 3 3 100平均 98 153 64.05

由表9可知，所有供试的153个菌株均对咯菌腈敏感，未能检测到抗性菌株，因此，咯菌腈可认为是目前蔬菜生产上防治灰霉病的首选药剂。

表9 不同寄主来源菌株对咯菌腈的抗性频率

4.讨论

长期以来，灰霉菌对农业生产造成了极其重大的危害，主要通过化学防治的方法进行防治，主要使用的化学药剂有苯胺基嘧啶类、苯并咪唑类、二甲酰亚胺类以及吡咯类等。但是，近年来国内外均相继报道了田间出现灰霉病菌对上述化学药剂产生抗性的菌株（王凌云等，2012）。本研究检测了采自不同地区、不同寄主上的153种灰霉菌菌株对四种药剂的抗药性情况。

研究结果表明，灰霉病菌对嘧霉胺、多菌灵、速克灵抗药性较为严重，均达到了60%以上，处于高抗水平；但咯菌腈对灰霉菌仍有较好的防治效果，这与之前国内报道的灰霉菌对几种药剂的抗药性情况基本相同（潘以楼等，2013）。采自不同地区以及不同寄主上的灰霉菌对上述几种药剂的抗性水平也有所不同，纵观检测结果发现，在所检测的不同地区中，除扬州外，其他各地的灰霉菌对嘧霉胺、多菌灵、速克灵均产生了非常普遍的抗药性；对与不同寄主来说，本研究采集样本数量较多的番茄和草莓上的灰霉菌对上述药剂也产生了严重的抗药性。分析原因可能是由于在某些地区及寄主上长期、单一使用上述药剂造成的。

综上所述，咯菌腈在防治灰霉病时可作为首选药剂，减少嘧霉胺、多菌灵和速克灵的使用；不同地区应对当地灰霉病菌抗药性进行重点监测，以指导科学用药。在药剂抗性严重地区或者抗性严重的寄主植物上停用该药剂一段时间，或者减少该类药剂的使用次数或使用量，尽量避免单剂使用；建议停止使用嘧霉胺、多菌灵或速克灵等高抗药剂，或使之与不同作用机制的杀菌剂复配或者交替使用，推荐使用吡咯类杀菌剂，如咯菌腈，但使用时仍应注意药剂的用量，并注意与其他杀菌剂配合使用。