谷子 SiMYB76基因抑制种子油脂积累的功能分析

刘 华 ，于芮芦，龚静云，王建军，李 东，陈明训

(西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

谷子(Setariaitalica)具有生命周期短、抗旱耐贫瘠、自花授粉、基因组小(～510Mb)等特点，不仅是中国干旱半干旱地区重要的粮食作物，而且是研究光合作用和非生物逆境等性状的新型模式植物[1-3]。谷子脱壳后俗称为小米，含有丰富的营养健康活性因子，如蛋白质、膳食纤维、油脂、酚类、植酸和矿物质等[4-5]。在谷子油中，不饱和脂肪酸组分含量约占总含油量的80%以上，其中，亚油酸组分的含量高达65.30%[6]。多不饱和脂肪酸，尤其是亚油酸，对降低胆固醇，预防癌症、高血压、心脑血管和炎症性疾病等均发挥重要的有益作用[7-8]。因此，谷子油有望成为一种新型营养保健油脂。目前关于谷子油脂代谢的研究报道尚不多见。分子育种作为一种高效育种手段，已被广泛应用于提高产量和提升营养品质等农作物育种实践。因此，挖掘与谷子油脂积累相关的关键基因，对通过分子育种手段提高谷子油产量和改进谷子油脂肪酸组分具有十分重要的意义。

在植物种子细胞中，油脂通常以三酰甘油(Triacylglycerol)的形式储藏于油体中，其生物合成受众多基因控制，大致可分为三个阶段[9-11]：阶段一是在质体中，利用糖酵解过程产生的乙酰辅酶A作为脂肪酸从头合成的前体合成16C-18C初级脂肪酸；阶段二是质体中合成的初级脂肪酸被运输到内质网，在一系列酶的催化作用下碳链得到进一步延长和去饱和等修饰进而生成长链(C≥20)和不饱和脂肪酸；阶段三是各类脂肪酸与甘油在多种酶的催化作用下生成三酰甘油储藏于种子油体中。

MYB转录因子是拟南芥(Arabidopsisthaliana)中最大的转录因子家族成员之一，通常在其N端具有高度保守的MYB结构域，该结构域通常包括3个不完全重复序列，每一个序列大约由53个氨基酸组成，并以特定的方式与DNA结合[12-13]。大量研究表明，拟南芥MYB家族转录因子参与了细胞分化、细胞周期的调控、激素和环境因子应答、植物次生代谢以及叶片等器官形态建成等生命活动过程[14-15]。近来的研究表明，MYB转录因子参与调控拟南芥种子油脂代谢过程。AtMYB89通过直接或间接调控与油脂合成相关的关键调节和结构基因的表达显著抑制种子油的积累[16]。AtMYB96通过结合AtFAE1基因的启动子区域而促进长链脂肪酸的生物合成[17]。AtMYB115和AtMYB118通过激活两个△-9棕榈酰酰基载体蛋白去饱和酶基因AtAAD2和AtAAD3的转录促进胚乳中ω-7脂肪酸的积累[18]。MYB123通过抑制FUSCA3和油脂合成途径上其他多个基因的表达而抑制种子油脂的积累[19-20]。前人的研究发现，AtMYB76转录因子显著促进拟南芥种子与叶片中脂肪族芥子油苷的形成[21-23]。研究表明，甘蓝型油菜和拟南芥MYB76通过调控油脂代谢过程中多个基因的表达显著抑制种子油脂的积累[24-25]。但谷子中该基因的同源基因SiMYB76在种子油脂积累过程中的调控作用尚不清楚。本研究以谷子品种‘豫谷1号’为试验材料，采用同源克隆法获得谷子SiMYB76基因的全长编码域序列(Coding domain sequence，CDC)，并在拟南芥中初步分析其在种子油脂积累过程中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 植物材料与培养

材料包括拟南芥野生型Columbia(Col-0)、功能缺失型突变体myb76-2[24-25]和谷子品种‘豫谷1号’。植物材料种植于人工培养箱内，温度为22 ℃，光周期为16 h光照和8 h黑暗，光照强度为160 μmol·m-2·s-1。

1.2 系统进化树构建

运用MEGA 7软件构建系统进化树，简要步骤如下：依据拟南芥AtMYB76蛋白序列，利用NCBI数据库中Protein BLAST工具，找到12个不同油料和禾本科植物物种的21个MYB76蛋白质同源序列，并将其保存为fasta格式。MEGA 7软件中，选择Jones-Taylor-Thornton矩阵模型，Neighbor-joining聚类方法，Bootstrap检验方法(1 000次重复，以检验系统进化树的可靠性)进行系统进化树的构建。13个不同物种与其对应的MYB76蛋白序列号详细信息如下：XP_013715419.1(BnaA10.SOI.a)，XP_022566456.1(BnaA3.SOI)，XP_013715418.1(BnaA10.SOI.b)和XP_013725873.2(BnaC3.SOI)(甘蓝型油菜，Brassicanapus)；AFY09820.1和AFY09-821.1(芥菜型油菜，Brassicajuncea)；XP_009131005.1(白菜型油菜，Brassicarapa)；XP_019090477.1，XP_010423177.1和XP_010491388.1(亚麻荠，Camelinasativa)；XP_016677671.1(棉花，Gossypiumhirsutum)；XP_015583755.1(蓖麻，Ricinuscommunis)；XP_004973509.1(SiMYB76)(谷子，S.italica)；XP_006399250.1(山嵛菜，Eutremasalsugineum)；XP_018443170.1和 XP_018473209.1(萝卜，Raphanussativus)；XP_006288096.1(辣椒，Capsellarubella)；XP_025683964.1，XP_025649949.1和XP_025693098.1(花生，Arachishypogaea)；NP_196387.1(AtMYB76)(拟南芥，A.thaliana)；AEV91158.1(普通小麦，Triticumaestivum)。

1.3 RNA提取与cDNA第一链合成

利用RNA提取试剂盒(TaKaRa，Code No.9769)提取谷子幼苗、拟南芥叶片与开花后第10、12和14天发育种子的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-1000分析总RNA的质量浓度。使用cDNA第一链合成试剂盒(TaKaRa，Code No.6210A)合成cDNA，储存于 -20 ℃，供后续试验使用。

1.4 基因克隆和植物表达载体构建

依据NCBI数据库中SiMYB76(XP_004973509.1)基因的CDS序列，设计特异性引物(表1)，以‘豫谷1号’幼苗cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶(TaKaRa，Code No.R045Q)通过PCR技术扩增目的基因。PCR反应程序如下：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，32个循环；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。切胶回收并用凝胶回收试剂盒(Omega，D2500-01)纯化目的片段。利用相同的限制性内切酶XmaⅠ和SpeⅠ分别对纯化后的目的片段以及pGreen-6 hemagglutinin(6HA)和pGreen-green fluorescent protein(GFP)植物双元表达载体进行酶切处理，使用T4连接酶(TaKaRa，Code No.2011A)将酶切后的目的片段与载体进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，随机筛选8个阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。这8个阳性克隆间的测序结果完全一致，并与目标序列完全一致，表明从‘豫谷1号’中成功获得SiMYB76基因的CDS 序列，并成功构建该基因的植物表达载体35S:SiMYB76-6HA和35S:SiMYB76-GFP。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 烟草叶片细胞的亚细胞定位

依据前人报道的农杆菌渗透法转染烟草(Nicotianabenthamiana)叶片[26-27]，分析谷子SiMYB76在烟草叶片细胞的亚细胞定位。简要流程如下：将35S:SiMYB76-GFP载体转染本氏烟草幼嫩叶片，72 h后，将DAPI(4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚)染液(1 mol·L-1Tris，pH 7.4， 5 mol·L-1NaCl，1 μg·L-1DAPI)注入上述烟草叶片中，30 min后，用激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 700，Germany)观察荧光信号并 拍照。

1.6 拟南芥转基因植株筛选与鉴定

将35S:SiMYB76-6HA载体转化农杆菌感受态细胞(AgrobacteriumtumefaciensGV3101)，并在含有50 μg·mL-1硫酸卡那霉素(Kanamycin)以及25 μg·mL-1利发霉素(Rifampicin)的LB培养基上随机挑取单克隆进行菌落PCR鉴定。使用农杆菌花序侵染法[28]转染拟南芥myb76-2突变体，将收获的种子均匀撒播在营养土上，待长出两片真叶后连续喷施草铵膦除草剂，后将抗性苗移栽至新营养土中生长，直到莲座叶期，对转基因单株进行基因型分析，确定是否成功转入目标基因，鉴定成功的株系即为T1代转基因株系，待长至成熟后收取种子，后将T2代种子置于含10 μg·mL-1草铵膦的MS培养基上继续筛选，直至获得T3代纯合体种子，供后续试验使用。

1.7 种子表型分析与脂肪酸含量测定

随机选取野生型、突变体和T3代纯合体种子，用体视显微镜(Olympus SZ 61，日本)观察种子大小、颜色并拍照。用电子天平(BSA124S-CW，中国)对种子质量进行测定。依据前人所述方法[29]对种子的脂肪酸含量进行测定。利用气质联用仪(GC-MS，7820-5977E，美国)对脂肪酸含量进行分析，具体设置如下：BPX-70 色谱分析柱(30 m×0.25 mm)，初始柱温为120 ℃，以 10 ℃·min-1的速率升至150 ℃，然后以 4 ℃·min-1的速率升至230 ℃，保持10 min。用面积归积法计算各脂肪酸含量，种子含油量为各脂肪酸含量的加和。

1.8 基因表达分析

利用实时荧光定量技术RT-qPCR分析基因表达情况。使用SYBR○RPremixExTaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa，Cat No. DRR 820A)进行RT-qPCR试验。试验所需引物见表1。参照试剂盒说明书，反应体系设定为20 μL，程序设定为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃变性20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环；72 ℃延伸 5 min，终止12 ℃ 10 min，4 ℃保存。每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复，以拟南芥管家基因AtEF1αA4为内参基因，利用2-△△Ct法对各基因的相对表达水平进行分析[30]。

1.9 试验设计与统计分析

采用至少3个生物学重复的完全随机设计试验。使用 SPSS 17.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 谷子SiMYB76序列分析

基于同源序列比对，于NCBI 数据库获得谷子品种‘豫谷1号’基因组中与拟南芥AtMYB76蛋白氨基酸序列同源率最高的同源基因，命名为SiMYB76(XP_004973509.1)，该基因在谷子基因组中只有1个拷贝。谷子SiMYB76基因位于第VI号染色体上，CDS序列为1 074 bp，编码357个氨基酸(图1)。蛋白多序列比对结果表明， SiMYB76与AtMYB76的氨基酸序列同源率达到51.3%，且它们myb-like DNA结合域的氨基酸序列同源率达到75.0%(图1)。对13个不同物种20个MYB76蛋白进行系统进化分析，结果表明，SiMYB76与小麦MYB76(AEV91158.1)亲缘关系最近，与AtMYB76蛋白亲缘关系较近(图2)。以上结果暗示SiMYB76与AtMYB76可能具有类似的生物学功能。

2.2 谷子SiMYB76定位于烟草叶片细胞的细胞核中

为了研究SiMYB76的亚细胞定位，使用激光共聚焦显微镜检测在本氏烟草叶片细胞中表达的融合蛋白SiMYB76-GFP的绿色荧光蛋白信号。如图3所示，绿色荧光蛋白信号特异性地定位于烟草叶片细胞的细胞核中，表明SiMYB76可能作为转录因子发挥调节作用。

2.3 谷子SiMYB76抑制种子油脂积累

甘蓝型油菜和拟南芥MYB76均显著抑制种子油脂的积累[24-25]。为了验证SiMYB76在种子油脂积累中的调控作用，将植物过表达载体35S:SiMYB76-6HA(图4-A)转入拟南芥myb76-2突变体。通过草铵膦除草剂筛选，共获得15个T1代转基因单株，用特异性引物35S_P/35S:SiMYB76-6HA-SpeΙ-R对转基因株系进行PCR鉴定。通过RT-qPCR技术检测野生型、突变体和鉴定获得的3个独立的T3代myb76-2 35S:SiMYB76纯合转基因株系(图4-B)中谷子SiMYB76基因的转录水平，结果显示SiMYB76基因在野生型和突变体中没有表达，在 3 个独立的过表达株系中均有表达且表达量间差异较小(图4-C)。利用气质联用仪测定野生型、突变体和T3代myb76-2 35S:SiMYB76纯合转基因株系种子的脂肪酸含量，结果表明，过表达SiMYB76基因能够使突变体种子高含油量的表型完全恢复到野生型水平(图5)。此外，野生型、突变体和T3代myb76-2 35S:SiMYB76纯合转基因株系间种子大小、颜色和质量等农艺性状无明显差异(图5-A～图 5-C)。以上结果证实谷子SiMYB76显著抑制种子的脂肪酸积累。

2.4 谷子SiMYB76抑制种子油脂合成相关基因的表达

为了探讨SiMYB76调控种子油脂积累的分子机制，选取Acetyl co-enzyme a carboxylase biotin carboxylasesubunit(AtCAC2)，Mosaic death1(AtMOD1)，Fatty acid elongation1(AtFAE1)，Fatty acid desaturase 2(AtFAD2)，AtFAD3和3-ketoacyl-coa synthase17(AtKCS17)等6个在拟南芥myb76-2突变体发育种子中被显著上调且促进种子油脂合成的关键基因[24]，利用RT-qPCR技术分析谷子SiMYB76对它们表达的影响。如图6所示，在第12和14天的发育种子中，突变体中AtCAC2、AtFAE1和AtKCS17基因的转录水平均显著高于野生型，在突变体基础上过表达SiMYB76能够使它们的表达量完全恢复至野生型水平。在第14天的发育种子中，突变体中AtMOD1、AtFAD2和AtFAD3基因的表达量显著高于野生型，其中，AtFAD2和AtFAD3基因的表达量在T3代纯合转基因株系myb76-2 35S：SiMYB76-6HA#3中完全恢复至野生型水平，而AtMOD1基因的表达量在转基因株系中低于突变体，但仍比野生型高。这些结果表明，在种子发育过程中，谷子SiMYB76通过抑制种子脂肪酸合成相关基因的表达而显著抑制种子油脂积累。

3 讨 论

在种子油脂积累过程中，转录调控发挥重要调节作用。谷子SiMYB76基因在种子脂肪酸积累过程中的调控作用尚不清楚。本研究发现SiMYB76基因在谷子基因组中只有1个拷贝，其编码的蛋白质与拟南芥AtMYB76蛋白亲缘关系较近，两者的氨基酸序列同源率较高，它们的myb-like DNA结合域的氨基酸序列同源率更高(图1-2)。SiMYB76定位于烟草叶片细胞的细胞核中，表明其可能作为转录因子发挥调节作用(图3)。在拟南芥myb76-2突变体中过表达SiMYB76基因不仅能够完全恢复突变体高含油量的表型，而且能够抑制与油脂合成相关基因的表达(图4-6)。这些结果表明单子叶植物谷子SiMYB76与双子叶植物油菜和拟南芥MYB76在调控种子油脂积累方面均具有类似的调控 功能。

前人的研究表明，乙酰辅酶A羧化酶(AtACCase)在拟南芥种子油脂合成过程中发挥十分重要的作用[31]，AtCAC2基因编码AtACCase亚基，广泛分布于植物组织和器官中，促进种子脂肪酸的合成[32]。AtMOD1基因编码一种烯脂酰酰基载体蛋白还原酶，它是脂肪酸合酶复合体的亚基，可催化脂肪酸从头合成，显著促进种子脂肪酸合成[33]。AtFAD2基因编码油酸脱氢酶，促使油酸转化为亚油酸[34]。AtFAD3基因编码亚油酸脱氢酶，促使亚油酸转化为亚麻酸[35]。 AtFAE1和AtKCS17属于KCS家族成员，在细胞质中参与长链脂肪酸的生物合成，促使脂肪酸碳链从C18延长至C20和C22[36-37]。本研究发现，在种子油脂积累关键时期，转基因株系myb76-2 35S：SiMYB76-6HA中AtCAC2，AtFAD2，AtFAD3，AtFAE1和AtKCS17等基因的表达量均完全恢复至野生型水平(图6)，然而AtMOD1基因的表达量部分恢复到野生型水平(图6)，这可能是由SiMYB76和AtMYB76的myb-like DNA结合域存在25个氨基酸差异导致的(图1)。这些结果表明SiMYB76与AtMYB76功能保守，均通过抑制脂肪酸合成相关基因表达而显著抑制种子的油脂积累。

谷子油含有丰富的不饱和脂肪酸[6]，有望成为一种新型营养保健油脂。本研究初步分析了谷子SiMYB76在种子脂肪酸积累过程中的调控作用，不仅为深入揭示其作用机制奠定了基础，而且为谷子的品质改良育种提供了优异基因资源。