枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01抑菌效果与对番茄枯萎病防效的初步研究

张萧萧，张心青，杨传伦，郭南南，车树刚，冉新新，王秀芝，傅英旬

（黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500）

枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种土传病害，可危害瓜类、豆类、茄果类等多种经济作物。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌［Fusarium oxysporum f.lycopersici（sacc）snyder et Hansen］引起的一种维管束病害。由于尖孢镰刀菌不断进化出新的生理小种，且其厚垣孢子能够长期在土壤中存活，使得番茄枯萎病的防治十分困难［1］。番茄是我国的主栽蔬菜之一，由于设施番茄连续种植，由枯萎病菌引起的土传病害连作障碍日趋严重，发病危害严重的大棚减产达30%～50%，已成为设施番茄安全生产的主要瓶颈［2］，严重影响番茄生产和品质。

目前生产上番茄枯萎病的防治主要有农业防治、化学防治与生物防治。采用高温闷棚等农业防治效果一直不理想，连作障碍发生依然严重；而大剂量化学农药处理易造成环境污染、农药残留等，严重危害人类健康与环境［3，4］。在农业供给侧结构性改革的大背景下，对环境干扰小、符合可持续发展理念和国家绿色兴农方针的生物防治成为研究热点。其中拮抗细菌作为土壤中的优势菌种，因其培养方便、生产周期短等优势应用最广，目前应用于番茄枯萎病防治的生防菌包括真菌、细菌、放线菌［5，6］，其中研究最热的细菌主要为芽孢杆菌（Bacillus spp.）和假单胞菌（Pesudomonas spp.）等［7－10］。虽然具有防病促生功能的生防细菌较多，但是具有广谱抗性和强适应力的菌种较少，通过筛选或改造获得抗菌活性高、抑菌谱广的菌种，成为生物防治番茄枯萎病的首要任务［11］。

本研究室前期已通过筛选与ARTP诱变，获得1株枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01，初步试验表明该突变株对番茄枯萎病菌具有较强的拮抗性与良好的遗传稳定性，盆栽试验防效达到75.76%［12］，本研究进一步测定了该菌株对其他作物枯萎病的抑制率和对番茄枯萎病的田间防治效果，以期为其商业化应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01是本实验室从连作番茄土壤中分离并经ARTP诱变筛选获得；作物枯萎病病原真菌包括番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、甜叶菊枯萎病菌、花椰菜枯萎病菌，26种真菌性病原菌（辣椒疫霉病菌、土豆立枯丝核病菌、棉花红腐病菌、水稻纹枯病菌、豇豆黑斑病菌、黄瓜红粉病菌、玉米小斑病菌、草莓褐斑病菌、草莓根腐病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、大豆链格孢病菌、核盘菌、苹果腐烂病菌、白菜炭疽病菌、湖南烟疫病菌、黄瓜黑星病菌、层生镰刀菌、黄瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌、花椰菜黑斑病菌、灰葡萄孢菌、小麦根腐病菌、黄瓜靶斑病菌、番茄叶霉病菌和番茄灰叶斑病菌）和3种细菌性病原菌（番茄青枯病菌、黄瓜角斑病菌、姜瘟病菌）均由本实验室保存。田间小区防效试验于2019年8—10月在博兴县店子镇试验大棚进行，供试品种为红粉。

1.1.2 培养基 （1）LB培养基：氯化钠10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g，搅拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固体加入1.8%～2.0%的琼脂粉，121℃灭菌20 min。（2）PDA培养基：取200 g土豆去皮切块，于800～900 mL蒸馏水中煮30～40 min，冷却后过滤，滤液中加入20 g葡萄糖，搅拌至完全溶解后定容至1 000mL，固体加入1.8%～2.0%的琼脂粉，121℃灭菌20 min。（3）发酵培养基：葡萄糖10 g，酵母膏3 g，K2HPO4·3H2O 2 g，MgSO40.25 g，豆粕20 g，氯化钠10 g，pH＝7.5，用蒸馏水混匀并定容至1 000 mL，121℃灭菌20 min。

1.1.3 主要设备 XSP－BM 系列生物显微镜，购自上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；SHP－150智能生化培养箱，购自上海博迅实业股份有限公司；SW－CJ－2F超净工作台，购自苏州苏洁净化设备有限公司；恒温振荡器，购于上海旻泉仪器有限公司；TG－16WS台式高速离心机，购自长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 突变株YJY19－01活化与培养 将枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01于固体LB平板进行活化，挑取单菌落接入含有100 mL LB液体培养基中，置于37℃、170 r／min摇床中培养14～16 h，制成种子液。以1%的接种量将种子液接种于发酵培养基中培养24 h，调节发酵液中枯草芽孢杆菌浓度至（1×109～1×1010）cfu／mL。

1.2.2 突变株YJY19－01对8种作物枯萎病病原真菌的抑制作用 采用平板对峙法：将8种作物枯萎病菌分别接种到PDA培养基平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌打孔器从菌落外缘均匀打出直径为8 mm的圆形菌块。将菌块接种在新的PDA平板中心，在其四周距中心25 mm等距离处接种突变株YJY19－01，对照组直接接种病原真菌菌饼，每处理3个重复，28℃恒温培养，待对照组病原菌长满平板时，采用十字交叉法［7，13］测定菌落直径并计算抑制率。

抑制率（%）＝（对照病原菌直径－处理病原菌直径）／对照病原菌直径×100。

1.2.3 突变株YJY19－01对其他病原菌的抑制作用 对真菌病原菌的抑制作用采用平板对峙法测定。真菌病原菌菌落为圆形或能覆盖YJY19－01菌，表示没有拮抗作用；菌落变形，如方形、菱形、花瓣形等，则视为具有拮抗作用。对细菌病原菌的抑制作用采用改良后的抑菌圈法［7］：在LB培养基上接种细菌病原菌进行活化，然后挑取单菌落接种至50 mL LB液体培养基中，于37℃、170 r／min振荡培养2 d，用无菌水稀释至108cfu／mL，在LB平板打孔加入50μL YJY19－01发酵液，并用病原细菌稀释液喷雾，37℃培养过夜，观察有无抑菌圈。若出现抑菌圈，则视为具有拮抗作用，若未出现抑菌圈，则表示没有拮抗作用。

1.2.4 田间小区防效试验［14，15］选择番茄枯萎病发生严重且连作3年以上的田块。共设3个处理：突变株YJY19－01菌剂组、50%多菌灵500倍稀释液药剂组和清水对照组。每个处理3次重复，共9个小区，每个小区面积为20 m2，随机排列。在番茄6～7片真叶时进行移栽，移栽时采用孢子悬浮液灌根法接种番茄枯萎病病菌。移栽10 d后进行第一次灌根处理，每棵苗300 mL，间隔15 d再灌根1次，共防治2次。30 d后调查番茄植株枯萎病发病情况，计算防效。

番茄枯萎病病情分级标准：0级，无症状；1级，1～2片真叶变黄或真叶萎焉下垂；2级，3～4片真叶变黄或萎焉下垂；3级，5～6片真叶变黄或真叶萎焉下垂；4级，全株严重萎焉，以致枯死。

发病率（%）＝处理发病株数／处理总株数×100；

病情指数＝∑（各级病株数×各级代表值）／（调查总株数×最高级代表值）×100；

防治效果（%）＝（对照区病情指数－试验区病情指数）／对照区病情指数×100。

2 结果与分析

2.1 突变株YJY19－01对8种作物枯萎病病原真菌的抑制作用

由图1、表1可以看出，枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01对8种作物枯萎病菌均有明显抑制作用，抑制率在75.06%～80.12%之间。

图1 突变株YJY19－01对8种作物枯萎病病原真菌的平板对峙结果

表1 突变株YJY19－01对8种作物枯萎病病原真菌的抑制率

2.2 突变株YJY19－01对其他常见作物病原菌的抑制作用

抑制作用结果（表2）表明，突变株YJY19－01除对8种作物枯萎病菌有抑制效果外，对其他26种作物真菌性病原菌和2株细菌性病原菌均有明显抑制效果，仅对姜瘟病菌无抑制效果。

表2 突变株YJY19－01对29种常见作物病原菌的抑制效果

2.3 田间防效试验

由表3可知，对照、药剂组和菌剂组的发病率分别为93.33%、26.67%和18.33%，病情指数分别为54.30、18.88和13.34，药剂组和菌剂组的防效分别为65.23%和75.43%，表明枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01对番茄枯萎病的防效高于常规药剂50%多菌灵500倍稀释液。

表3 突变株YJY19－01对番茄枯萎病的田间防效

3 讨论与结论

博兴县店子镇有“中国优质西红柿之乡”的美称，由于番茄连年栽种导致其枯萎病等土传病害日渐加重，严重影响了番茄产量与品质。由于我国农业耕地现状、安全、环保政策等原因，生物防治得到了迅速发展，其中芽孢杆菌，特别是枯草芽孢杆菌，因为具有安全性和能产生抗菌物质等特性，被广泛用来防治植物病害［16］。但是生物防治也存在一些不足，如田间防治效果不稳定、药效作用缓慢、抑菌谱较窄［17］等。枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01是本实验室前期通过筛选并经ARTP诱变获得，具有良好的遗传稳定性。本研究结果表明，突变株YJY19－01具有广谱抑菌性，除对8种作物枯萎病菌有较高的抑制效果外，还对其他26种真菌性病原菌和2种细菌性病原菌具有明显抑制效果；另外田间试验结果表明突变株YJY19－01对番茄枯萎病的田间防效在75%以上，与前期盆栽防效一致，进一步表明突变株YJY19－01是一株对番茄枯萎病具有稳定拮抗效果的生防菌，也是一株针对多种作物病害具有潜在防效的生防菌。

芽孢杆菌防治植物枯萎病的作用机制主要包含4个方面，即竞争、拮抗、诱导作物的抗病性和促进作物生长［18］。大量研究结果表明芽孢杆菌能分泌多种抗菌物质，包括抗生素、脂肽、抗菌蛋白等，从而抑制植物病菌的生长［19－22］。胡陈云等［23］研究发现枯草芽孢杆菌ge25产生的fengycin类脂肽（含C-16 fengycin A和C-15～C-18 fengycin B同系物或衍生物）会显著抑制人参黑斑菌和锈腐菌的正常生长，破坏病原菌的菌丝结构，改变菌丝细胞膜通透性。枯草芽孢杆菌突变株YJY19－01的抑菌机理还有待进一步研究。

由于生物防治存在的一些不足［18，19］，其还不能完全取代化学药物，枯萎病等土传病害的治理在努力采用新技术的同时，也要注意各单项防治技术的互相配合，近年来发展形成的生物与化学相结合的策略［24－27］，既能有效控制病害，又能降低化学农药使用量，但是高浓度的化学药剂对拮抗细菌生长一般都有抑制作用，因此突变株YJY19－01与常用低毒化学药剂的相容性也需要进一步研究，为运用生物防治和高效低毒农药的综合防治提供依据。