墓头回药材中总黄酮和总皂苷测定方法研究

王嘉琛,张莉丹,王伊楠,郭宇航,董征艳,姚隆丹,段秀俊*

(1山西药科职业学院中药检定教研室,太原 030001;2山西中医药大学中药教研室;*通讯作者,E-mail:dxjzhyxy@163.com)

据《山西省中药材标准》记载,墓头回为败酱科植物糙叶败酱(Patrinia scabra Bunge)的干燥根[1],别名九头鸟、脚汗草[2]。除西藏、青海外,在我国大部分地区均有分布。具有清热燥湿、止血、止带、截疟的功效。现代研究表明墓头回中含有的黄酮、皂苷等成分,具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞生长、提高机体免疫力等多种药理作用[3-6]。但暂无文献对其中黄酮、皂苷等有效成分的测定方法进行研究。本试验采用紫外-可见分光光度法,建立了测定墓头回中总皂苷及总黄酮含量的方法,为墓头回的质量控制提供有价值的试验依据。

1 试验材料

1.1 仪器

UV-610S紫外-可见分光光度计(上海元析仪器责任有限公司)、ATY224分析天平(万分之一,日本岛津公司)、UW120D分析天平(十万分之一,日本岛津公司)、KQ5200V超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司),HH-2数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司),SY-2000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)等。

1.2 药材与试剂

墓头回经山西中医药大学段秀俊副教授鉴定为败酱科植物糙叶败酱(Patrinia scabra Bunge)的干燥根。芦丁对照品(批号100080-200707)、齐墩果酸对照品(批号110709-201206)均购于中国食品药品检定研究院,甲醇(批号20151218,天津市科密欧化学试剂有限公司),香草醛(批号20140304,天津市科密欧化学试剂有限公司),冰醋酸(批号20160304,天津市科密欧化学试剂有限公司),乙醚(批号20140316,天津市风船化学试剂有限公司),正丁醇(批号20190108,天津市东丽区新中村),高氯酸(批号20131105,天津政成化学制品有限公司),以上试剂均为分析纯;水为超纯水。

2 试验方法与结果

2.1 总皂苷的含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 取墓头回粉末(过五号筛)约0.5 g,精密称定,置150 ml具塞锥形瓶中,加入甲醇20 ml,置超声波清洗器中超声提取40 min,水浴80 ℃挥干甲醇,加热水20 ml使溶解,用乙醚脱脂2次,每次20 ml。取水层用水饱和的正丁醇萃取4次,每次50 ml,收集正丁醇液,加2倍5%氨水试液洗涤2次[7-10]。挥干正丁醇并用甲醇定容至5 ml容量瓶中,滤过,取续滤液1 ml,置10 ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品适量,加甲醇溶解并定容,制成浓度为0.524 mg/ml的溶液作为对照品溶液。

2.1.3 检测波长的确定 精密吸取对照品溶液0.2 ml于10 ml具塞刻度试管中,80 ℃水浴挥干甲醇,冷却后准确加入1%香草醛乙酸-高氯酸溶液0.5 ml,立即摇匀,60 ℃恒温水浴上充分加热15 min,取出,冷却5 min,准确加入冰醋酸3 ml,摇匀,静置5 min,以空白溶液为对照,在波长400-700 nm范围内扫描,结果显示齐墩果酸在545 nm处有最大吸收,因此选择545 nm为检测波长。

2.1.4 显色条件的研究

2.1.4.1 单因素试验 试验分别考察了反应温度、显色时间、显色剂用量(1%香草醛乙酸-高氯酸溶液)及冰醋酸用量对试验结果的影响,结果显示反应温度为80 ℃,显色时间为25 min,显色剂用量为0.5 ml,冰醋酸用量为3 ml时,为最佳条件。但因冰醋酸用量对显色结果无显著影响,故选择反应温度、显色时间、显色剂用量进行正交试验。

2.1.4.2 正交试验 根据单因素试验结果,以吸光度为考察指标,反应温度(℃)、显色时间(min)、显色剂用量(ml)为考察因素,每因素设定3个水平。采用L9(34)正交试验表进行试验。因素与水平见表1,试验结果见表2,3。

表2 总皂苷正交试验结果Table 2 The orthogonal test results of total saponins

表3 总皂苷方差分析表Table 3 Variance analysis of total saponins

由试验结果可知,3个因素对显色效果的影响为A>B>D。反应温度对墓头回总皂苷的测定有显著性影响(P<0.05),显色时间和显色剂用量没有显著性影响(P>0.05)。实际试验最佳组合为A2B1D3,统计学为A2B1D2,将结果重复3次,无统计学差异。为节约时间,最终选A2B1D2为最佳组合,即反应温度为80 ℃,反应时间为20 min,显色剂加入量为0.5 ml。

2.1.4.3 显示条件的确定 根据单因素及正交试验结果,确定墓头回中总皂苷的含量测定方法为:精密吸取供试品溶液0.2 ml于10 ml具塞刻度试管中,80 ℃水浴挥干甲醇,冷却后准确加入1%香草醛乙酸-高氯酸溶液0.5 ml,立即摇匀,80 ℃恒温水浴上充分加热20 min,取出,立即冷却后准确加入冰醋酸3 ml,摇匀,静置5 min,以相应试剂为空白溶液随行对照,于545 nm测吸光度。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 线性关系的考察 精密吸取不同浓度对照品储备液适量,按照“2.1.4.3”项下测定吸光度值,以对照品溶液的浓度C为横坐标,以吸光度A为纵坐标作图,得回归方程:A=0.036 7C+0.027 1(r=0.997)。结果表明齐墩果酸在5.24-52.4 μg/ml范围内线性关系良好。

2.1.5.2 精密度考察 精密吸取对照品溶液,按“2.1.4.3”项下方法连续测定6次吸光度,结果显示RSD<3%,表明仪器精密度良好。

2.1.5.3 稳定性考察 按“2.1.1”项下制备供试品溶液,每隔10 min按“2.1.4.3”项下方法测定一次吸光度,结果显示RSD<3%,说明供试品溶液吸光度在1 h内稳定。

2.1.5.4 重复性考察 取墓头回粉末6份,每份约0.5 g,精密称定,按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液,按“2.1.4.3”项下方法测定,结果显示RSD<3%,表明该方法重现性良好。

2.1.5.5 加样回收率考察 精密称取已知总皂苷含量的墓头回药材干粉6份,每份约0.25 g,按样品含有量与对照品1:1的比例加入齐墩果酸对照品,按“2.1.1”项下制备供试品溶液,按“2.1.4.3”项下方法显色并测定总皂苷含量,计算回收率,结果见表4,平均加样回收率为101.1%,RSD<3%,表明该方法准确性良好。

表4 总皂苷加样回收率试验结果 (n=6)Table 4 Results of recovery tests for total saponins (n=6)

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备 取墓头回药材粉末(过五号筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加适量60%乙醇,超声提取20 min,滤过,用同样的方法处理滤渣,合并滤液,用60%乙醇定容于25 ml容量瓶中,即得[11]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品适量,加60%乙醇溶解并定容,制成浓度为0.31 mg/ml的溶液作为对照品溶液。

2.2.3 检测波长的选择 精密吸取芦丁对照品溶液2 ml,置于10 ml容量瓶中,加60%乙醇2 ml,加5%亚硝酸钠溶液1 ml,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,放置6 min,加10%氢氧化钠溶液2 ml,60%乙醇定容至刻度,摇匀,在20 ℃下,静置15 min。以空白溶液为对照,分别用全波长扫描二者的吸收图谱,结果显示对照品溶液在507 nm处有最大吸光度,故选择507 nm为检测波长。

2.2.4 显色条件的研究

2.2.4.1 单因素试验 试验分别考察了硝酸铝溶液加入量、静置时间、显色温度[12-14]对试验结果的影响,结果显示硝酸铝溶液加入量为1.3 ml,静置时间为25 min,显色温度为25 ℃时,为最佳条件。而且3个因素对显色结果都有较大的影响,故对此3个因素进行正交试验。

2.2.4.2 正交试验 根据单因素试验结果,以吸光度为考察指标,硝酸铝溶液加入量(ml)、静置时间(min)、显色温度(℃)为考察因素,每因素设定3个水平,采用L9(34)进行了正交试验,因素与水平见表5,试验结果见表6,7。

表5 总黄酮正交试验因素与水平Table 5 Orthogonal analytical factors and levels of total flavonoids

表6 总黄酮正交试验结果Table 6 The results of total flavonoids orthogonal test

表7 总黄酮方差分析表Table 7 Variance analysis of total flavonoids

由试验结果可知,3个因素对显色效果的影响为A>B>D。硝酸铝溶液加入量(A)对总黄酮的测定有显著性影响(P<0.05),静置时间(B)和显色温度(D)没有显著性影响(P>0.05)。试验最佳组合为A3B2D3,统计学最佳组合为A3B2D1,将结果重复3次,差异无统计学意义。为节约资源,最终选择A3B2D1为最佳组合,即硝酸铝溶液加入量为1.5 ml、静置时间为25 min、显色温度为20 ℃。

2.2.4.3 显色条件的确定 根据单因素及正交试验结果,确定墓头回中总黄酮的含量测定方法为:精密量取供试品溶液2 ml于10 ml容量瓶中,加60%乙醇2 ml,加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml,放置6 min;加10%硝酸铝溶液1.5 ml,放置6 min;加10%氢氧化钠溶液2 ml,60%乙醇定容至刻度,摇匀,在20 ℃,静置25 min。以相应试剂作空白对照,于507 nm处测定吸光度。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性关系的考察 精密吸取不同浓度对照品储备液适量,按“2.2.4.3”项下同法测定吸光度,以对照品溶液的浓度C为横坐标,以吸光度A为纵坐标作图,得回归方程:A=0.857 3C+0.158 3(r=0.995 4)。结果表明芦丁在0.062-0.62 mg/ml范围内线性关系良好。

2.2.5.2 精密度考察 精密吸取对照品溶液,按“2.2.4.3”项下方法连续测定6次吸光度,结果显示RSD<3%,表明仪器精密度良好。

2.2.5.3 稳定性考察 按“2.2.1”项下制备供试品溶液,每隔10 min按“2.2.4.3”项下方法测定一次吸光度,结果显示RSD<3%,说明供试品溶液吸光度在1 h内稳定。

2.2.5.4 重复性考察 取墓头回粉末6份,每份约0.5 g,精密称定,按“2.2.1”项下的方法配制备供试品溶液,按“2.2.4.3”项下方法测定,结果显示RSD<3%,表明该方法重现性良好。

2.2.5.5 加样回收率考察 精密称取已知总黄酮含量的墓头回药材干粉6份,每份约0.25 g,按样品含量与对照品1:1的比例加入芦丁对照品,按“2.2.1”项下制备供试品溶液,按“2.2.4.3”项下方法显色并测定总黄酮含量,计算回收率,结果见表8,平均加样回收率为100.91%,RSD<3%,表明该方法准确性良好。

表8 总黄酮加样回收率试验结果 (n=6)Table 8 Results of recovery test for total flavonoids (n=6)

3 讨论

墓头回首载于明代《救荒本草》之中,有“叶似野菊花叶而窄细;稍叶间开五瓣小黄花,其叶味微苦”的记载[15]。在《本草纲目》《植物名实图考》等古代医药典籍[16,17]以及近现代药学著作如《中药材品种论述》《中国植物志》中多有记载[18,19]。但因历史原因,各地对墓头回来源的记载并不完全相同。如《甘肃省中药材标准》记载墓头回为“败酱科植物糙叶败酱或异叶败酱的干燥根及根茎或鲜品”[20]。《中华本草》记载为“败酱科植物糙叶败酱或异叶败酱的干燥根”[2]。1987年版《山西省中药材标准》记载为“败酱科植物糙叶败酱的干燥根”[1]。为了扩大试验结果的应用范围,本试验选取了接受度较为广泛的糙叶败酱进行研究。

现代药理研究表明,墓头回中的黄酮类成分具有抗肿瘤、抗氧化、镇静的作用[21];皂苷类成分能够提高机体免疫力,具有抗炎、抗菌的作用[22]。考虑到中药有效成分对现代药理学的作用,本试验对墓头回中总黄酮和总皂苷的测定方法进行研究。以吸光度为指标,对影响墓头回中总黄酮测定的反应温度、显色时间、显色剂用量进行考察;对影响总皂苷测定的硝酸铝溶液加入量、静置时间、显色温度进行考察,通过优化显色条件,确定了最佳显色方式。同时采用方法学考察对此显色方式进行评估,确定了方法简便、结果可靠的测定方式,可以更加全面准确地评价墓头回的质量,也为墓头回的开发利用提供了基础。但本试验并未筛选出墓头回质量评价标志物,这为墓头回的进一步研究提供了方向。