β-榄香烯通过下调Afadin蛋白磷酸化水平抑制结肠癌SW480细胞的迁移与侵袭

桂林，梁春慧，于溯洋，程敏静，卞红磊

研究发现，结肠癌组织中存在Afadin蛋白磷酸化水平的改变[1]，与此同时，Afadin作为Akt的底物之一，其磷酸化状态参与调控结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。在某些类型的肿瘤中，榄香烯能够对PI3K/Akt信号通路的活性产生影响，上调或下调底物磷酸化水平[2]，由此推测，榄香烯可能也会对结肠癌细胞内Afadin的磷酸化水平产生影响，为了验证这种假设，现利用β-榄香烯对结肠癌SW480细胞进行处理，观察细胞内Afadin蛋白磷酸化水平的改变并分析其对细胞迁移以及侵袭的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞：结肠癌SW480细胞购自美国典型培养物保藏中心。(2)药品与试剂：β-榄香烯购自石药集团远大制药有限公司，重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)购自R&D公司，2-吗啉代-8-苯基色酮(LY294002)、兔抗人Afadin多克隆抗体及抗人磷酸化Afadin抗体购自Abcam公司，兔抗人Akt 抗体和抗人磷酸化Akt 抗体购自Cell Signaling 公司，内参GAPDH抗体购自Cst 公司，基质胶购自BD公司，BCA蛋白定量试剂盒及ECL发光检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。(3)仪器设备：Transwell小室购自美国Corning公司，培养箱购自美国REVCO公司，BX53显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 实验方法 2019年10月—2020年1月于河北中医学院实验中心进行实验。将SW480细胞分为6组。对照组：取复苏后的结肠癌SW480细胞10 ml(细胞浓度为5×106/ml)，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、含有5%CO2饱和湿度的培养箱中培养；IGF-1组：细胞培养同对照组，培养基中加入IGF-1，使其最终浓度达到50 ng/ml；LY294002组：细胞培养同对照组，培养基中加入LY294002，使其最终浓度为10 μmol/L；榄香烯组：细胞培养同对照组，培养基中加入β-榄香烯，使其最终浓度达到20 μg/ml；榄香烯+IGF-1组：细胞培养同对照组，培养基中加入β-榄香烯及IGF-1，使其最终浓度分别达到20 μg/ml、50 ng/ml；榄香烯+ LY294002组：细胞培养同对照组，培养基中加入β-榄香烯及LY294002，使其最终浓度分别达到20 μg/ml、10 μmol/L，各组均培养72 h。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 Western-blot检测结肠癌细胞内Akt、磷酸化Akt、Afadin及磷酸化Afadin蛋白表达水平：从结肠癌细胞中提取总蛋白，BCA法蛋白定量，每组上样20 μg，分离转膜，1抗孵育过夜，2抗孵育1.5 h，ECL显影，以GAPDH为内参分别计算Akt、磷酸化Akt及Afadin、磷酸化Afadin的蛋白表达水平。

1.3.2 划痕实验检测结肠癌细胞迁移能力：在96孔板中加入结肠癌SW480细胞约3×104个，以次日细胞达到90%以上汇合度为准，更换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。使用无血清培养基轻轻漂洗2～3遍，拍照。在37℃、含有5%CO2的培养箱中培养24 h，以96孔中心阴影区域为参照，划痕在图片的正中进行拍照。根据图片计算各组细胞迁移率。

1.3.3 Transwell侵袭实验检测结肠癌细胞侵袭能力：每个小室中加入基质胶50 μl，铺匀，放置培养箱中孵育1～2 h。小心除去上室中培养基并加入细胞悬液100 μl(浓度为1×106/ml)，下室内加入含有30% FBS的培养基600 μl。37 ℃培养箱培养24 h，倒置小室于吸水纸上去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，滴2～3滴吉姆萨染液到膜的下表面染色转移细胞3～5 min，将小室浸泡冲洗数次，晾干。每个Transwell小室随机选取视野于显微镜下拍照后计数并进行数据分析。

2 结 果

2.1 各组结肠癌细胞Akt、磷酸化Akt及Afadin、磷酸化Afadin蛋白表达水平比较 与对照组比较，IGF-1组磷酸化Akt及磷酸化Afadin蛋白表达水平升高，LY294002组、榄香烯组上述蛋白表达水平降低；与榄香烯组比较，榄香烯+ICF-1组磷酸化Akt及磷酸化Afadin蛋白表达水平升高，榄香烯+LY294002组上述蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；各组结肠癌细胞Akt、Afadin蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

表1 各组SW480细胞Akt、磷酸化Akt、Afadin及磷酸化Afadin蛋白表达水平比较

注：1.对照组；2.IGF-1组；3.LY294002组；4.榄香烯组；5.榄香烯+IGF-1组；6.榄香烯+ LY294002组图1 各组SW480细胞Akt、磷酸化Akt及Afadin、磷酸化Afadin蛋白表达水平比较

2.2 各组结肠癌细胞迁移能力比较 与对照组比较，IGF-1组细胞迁移率升高，LY294002组、榄香烯组细胞迁移率降低；与榄香烯组比较，榄香烯+ICF-1组细胞迁移率升高，榄香烯+LY294002组细胞迁移率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

图2 各组SW480细胞迁移能力比较

表2 各组SW480细胞的迁移率与穿透基底膜的细胞数量比较

2.3 各组结肠癌细胞侵袭能力比较 与对照组比较，IGF-1组穿透基底膜的细胞数量升高，LY294002组、榄香烯组穿透基底膜的细胞数量降低；与榄香烯组比较，榄香烯+ICF-1组穿透基底膜的细胞数量升高，榄香烯+LY294002组穿透基底膜的细胞数量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图3。

图3 各组SW480细胞侵袭能力比较(箭头所指系穿透基底膜的细胞)

3 讨 论

β-榄香烯是从中药莪术根茎中提取的萜烯类化合物，具有广谱抗肿瘤作用[3-4]。在结肠癌领域，目前的研究主要集中在β-榄香烯对于凋亡、增殖、上皮细胞间质转化的影响，特别是逆转耐药及放疗增敏等方面[5-9]，对于β-榄香烯是否参与调控结肠癌细胞的迁移及侵袭能力，相关研究较少。本研究利用β-榄香烯对结肠癌细胞进行处理，然后通过划痕实验及Transwell侵袭实验观察细胞迁移及侵袭能力变化，结果显示，经过β-榄香烯处理的结肠癌细胞，其侵袭及迁移能力明显减弱，提示榄香烯能够抑制结肠癌的侵袭及迁移。

PI3K/Akt信号传导通路在肿瘤的发生发展过程发挥着重要的作用,通过Akt磷酸化水平变化，将信号传导到下一级的效应通路，广泛调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、自噬等生物学行为,其中也包括迁移及侵袭[10-12]。相关研究显示，针对不同类型的肿瘤细胞，β-榄香烯会对PI3K/Akt信号通路产生截然不同的影响，例如对于肾细胞癌细胞、膀胱癌细胞及三阴乳腺癌细胞[13-15]，β-榄香烯会对PI3K/Akt信号通路产生抑制，降低磷酸化Akt的表达水平，由此产生诱导凋亡、抑制增殖及增强化疗效果的作用。而对于肺腺癌PC9细胞及非小细胞肺癌A549细胞来说，应用β-榄香烯处理却会导致PI3K/Akt信号通路活化，磷酸化Akt表达增加[16-17]，由此可见，β-榄香烯对PI3K/Akt信号通路的影响具有一定的肿瘤类型特异性。在本研究中，分别使用β-榄香烯、PI3K/Akt信号通路激动剂IGF-1和 Akt磷酸化非特异性抑制剂LY294002对SW480细胞进行处理，结果显示，经过β-榄香烯处理的结肠癌细胞，细胞内Akt总量并没有明显变化，但是磷酸化Akt的蛋白表达水平却明显降低，显示出与LY294002类似的结果，并且β-榄香烯能够明显抑制IGF-1对Akt的磷酸化，提示对于结肠癌细胞，β-榄香烯对PI3K/Akt信号通路的活性发挥抑制作用[18-19]。

研究显示，细胞黏附连接关键蛋白Afadin可以作为底物被Akt磷酸化，从而调控结肠癌细胞迁移与侵袭能力。本研究发现，经过β-榄香烯处理，伴随着磷酸化Akt的蛋白表达水平降低，结肠癌细胞中磷酸化Afadin水平也明显降低，结果再次证实，对于结肠癌细胞来说，Afadin蛋白的磷酸化状态受Akt活性调控，而β-榄香烯能够通过抑制Akt的活化，降低结肠癌细胞中Afadin蛋白的磷酸化水平。与此同时，本研究还显示，应用IGF-1能够促进磷酸化Akt及磷酸化Afadin的表达，增强结肠癌细胞的迁徙及侵袭能力，而应用β-榄香烯或LY294002处理细胞，可以逆转IGF-1的作用，在降低磷酸化Akt及磷酸化Afadin表达水平的同时，减弱结肠癌细胞的迁移及侵袭能力，结果提示，β-榄香烯能够抑制PI3K/Akt信号通路的活化，进而下调Afadin的磷酸化水平，由此发挥抑制结肠癌细胞迁移及侵袭的作用。

综上所述，β-榄香烯能够抑制结肠癌细胞的迁移与侵袭，其机制与β-榄香烯抑制PI3K/Akt信号通路，从而导致Afadin蛋白磷酸化水平下调有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

桂林：设计研究方案，参与实施研究过程，论文撰写；梁春慧：实施研究过程，参与论文撰写；于溯洋：分析试验数据，进行统计学分析；程敏静：资料搜集整理，论文修改；卞红磊：课题设计，论文修改与审核