马铃薯腐烂茎线虫生防细菌的筛选与鉴定

张 妞，王 东，赵远征，项 鹏，邱廷艳，赵 鑫，高腾达，高志超，周洪友

（1内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，呼和浩特010018；2内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，呼和浩特010031；3黑龙江省农业科学院黑河分院，黑龙江黑河164312；4内蒙古喀喇沁旗农牧局植保植检站，内蒙古喀喇沁旗024409）

0 引言

马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchusdestructor，属于迁移性植物内寄生线虫，是国际公认的检疫性线虫[1-2]。该线虫主要为害马铃薯和甘薯，侵染薯块后，薯块表皮皱缩、龟裂，内部褐色并逐渐变黑，后期伴有细菌和螨类二次侵染，导致整薯腐烂变质[3]。马铃薯腐烂茎线虫病在北京、天津、山东、河北、河南、江苏、新疆、甘肃等地均有发生，并以山东、河北两省最为严重，已成为北方甘薯最严重的病害之一[4]。该病害可造成甘薯和马铃薯减产30%～50%，严重时可减产80%以上，甚至绝收[5-7]，严重影响其产量和品质。目前利用生物防治措施控制植物线虫病害已经取得了一定的研究进展，张国锋等[8]研究表明，利用30 kg/hm2的厚孢轮枝菌（孢子2.5亿个/g）和45 kg/hm2的淡紫拟青霉颗粒剂（5亿/g孢子）可有效防治甘薯茎线虫病，防治效果分别达70.94%和67.56%。高春梅等[9]研究表明丛枝菌根真菌(AMF)和暗隔内生真菌(DSE)组合菌剂抑制南方根结线虫的发育，降低线虫繁殖量、根内定殖数、发病率和根结指数。Lax等[10]研究发现接种根内球囊霉Glomus intraradices能有效地减轻南方根结线虫Meloidogyne incognita对番茄根系的伤害，降低线虫繁殖量。Noor等[11]研究发现，来源于马铃薯根及块茎的内生细菌能够抑制马铃薯胞囊线虫的胞囊和二龄幼虫(J2)形成，其中对胞囊数量的抑制率为51.7%～65.4%，对J2数量的抑制效果达到48.6%～76.4%。芽胞杆菌是用于防控植物线虫病害的重要生防因子。有研究表明，苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis和巨大芽胞杆菌B.megaterium对马铃薯腐烂茎线虫均具有较高的杀线活性[12-13]。Zeng等[14]分离获得的芽胞杆菌菌株SMrs28的发酵液粗提物表现出较强的杀线虫活性，其主要化合物对腐烂茎线虫具有毒杀作用。Jonathand等[15]利用蜡状芽胞杆菌B.cereus等根际细菌防治南方根结线虫M.incognita，使根结指数由94%下降至25%～31%。生物防治具有对非靶标生物安全、致毒作用小、环境兼容性好、不产生抗药性等优点，已成为防控腐烂茎线虫病害的重要手段。本研究通过利用34个细菌菌株发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的杀线活性进行测定，筛选出具有高效触杀活性的生防细菌菌株并明确其分类地位，为微生物杀线剂的研发与应用提供思路，旨在为生产上防治马铃薯腐烂茎线虫病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、线虫

供试细菌菌株共34个，-80℃条件下保存于内蒙古农业大学园艺与植保学院植物病理研究室；马铃薯腐烂茎线虫D.destructor分离自发病的马铃薯病薯，并转接于健康的马铃薯薯块中进行扩繁，室温条件下保存于内蒙古农业大学园艺与植保学院植物病理研究室。

1.2 主要试剂、药品

细菌基因组DNA试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；EasyTaqPCR supermix，购自北京全式金生物技术有限公司；2×TaqPCR Mix购自生物工程大连有限公司；TAE缓冲液，购自购自上海生工生物工程有限公司；核酸染料，购自百泰克生物科技有限公司；琼脂粉，购自上海致化化学科技有限公司；琼脂，购自BioFroxx公司；葡萄糖、氯化钠分析纯，购自天津永晟精细化工有限公司；LP0021酵母浸粉，购自OXOID公司。

1.3 主要仪器

NSZ-606体视显微镜，宁波永新光学股份有限公司生产；5424离心机，德国Eppendorf公司生产；KGSX-500蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology公司生产；HWS-26电热恒温水浴锅，上海-恒科学仪器有限公司生产；S1000 PCR扩增仪、Universal Hood II凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司生产；JY-ECP3000电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司生产；XPH-160BSH-III恒温恒湿箱，上海新苗医疗器械制造有限公司生产；JY2002电子天平，上海浦春计量仪器有限公司生产；EL20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；Eco-Q30纯水系统，上海和泰仪器有限公司生产；VS-840-U净化工作台，苏州博莱尔净化设备有限公司生产；3513型12孔细胞培养板，康宁生命科学（吴江）有限公司生产。

1.4 供试培养基

1.4.1 LB固态培养基 酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.2。

1.4.2 LB液态培养基 酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.2。

1.4.3 碳源利用基础培养基 KH2PO42.38 g、K2HPO4·3H2O 5.65 g、(NH4)2SO42.64 g、CuSO45H2O 6.4 mg、MgSO4·7H2O 1 g、ZnSO4·7H2O 1.5 mg、MnCl2·7H2O 7.9 mg、FeSO4·7H2O 1.1 mg、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.4 氮源利用基础培养基 葡萄糖10 g、K2HPO4·3H2O1g、MgSO4·7H2O5g、NaCl5g、FeSO4·7H2O10mg、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.2。

1.4.5 淀粉水解培养基 可溶性淀粉10 g、K2HPO4·3H2O 0.3 g、MgCO30.3 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.6 V-P测定液态培养基 胰化蛋白胨7 g、葡萄糖5 g、K2HPO45 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.7 接触酶培养基 胰化蛋白胨20 g、NaHPO42 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.8 H2S产生培养基 胰化蛋白胨2.5 g、NaCl 5 g、酵母提取物7.5 g、琼胶120 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.9 吲哚产生液态培养基 胰化蛋白胨20 g、NaHPO42 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.10 硝酸盐液态培养基 胰化蛋白胨10 g、KNO31 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.2。

1.4.11 明胶培养基 葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、明胶200 g、蒸馏水1000 mL。

1.5 线虫分离与悬浮液制备

采用改良贝曼漏斗法[16-17]从马铃薯病薯中分离马铃薯腐烂茎线虫，用吸管将分离到的线虫转移至10 mL离心管中，加入35%的蔗糖溶液后3500 r/min离心2 min；取上层线虫悬浮液，转移至无菌水中，4000 r/min离心5 min；弃上清液，用0.5%的次氯酸钠消毒1 min后，4000 r/min离心5 min；弃上清液，加入0.5%硫酸链霉素和0.5%青霉素的混合液中消毒6 min，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗3次，线虫悬浮液（约1000条/mL），4℃保存备用[18]。

1.6 菌株发酵液的制备

将34个菌株于LB培养基平板上进行活化，利用9 mm打孔器打成菌饼放入250 mL三角瓶，每瓶装入100 mL液体培养基中，25℃～28℃下，150 ～180 r/min摇床发酵2～3天后将菌株的发酵液6000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.7 菌株发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的室内触杀活性筛选

采用直接触杀法[19]，将马铃薯腐烂茎线虫悬浮液分装在2 mL离心管中，每管约含100条线虫，5000 r/min离心1 min，弃上清液，用移液枪将菌株发酵液上清液先加入2 mL离心管中，每个离心管中加入1.5 mL菌液，在微型漩涡混合仪充分震荡，每个处理重复3次，以无菌水为对照。用橡皮筋固定，放入无菌聚乙烯塑料袋中，25℃恒温培养48 h后在显微镜下进行观察，记录马铃薯腐烂茎线虫的总数以及死亡数。

计算马铃薯腐烂茎线虫的死亡率公式(1)和校正死亡率公式(2)，并使用IBM SPSS Statistics 24.0进行数据进行显著性分析。

1.8 菌株鉴定

1.8.1 菌株生理生化鉴定 参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株生理生化特征进行鉴定，主要有碳素化合物的利用：L-阿拉伯糖、D-木糖、葡萄糖、D-山梨醇、蔗糖、i-肌醇、水杨苷、V.P.试验；氮素化合物的利用：硝酸钾、硝酸铵、L-羟脯氨酸、硝酸盐还原、H2S的产生、吲哚的产生；其他反应测定：淀粉水解、接触酶、明胶液化[20-22]。

1.8.2 菌株的16S rDNA鉴定 筛选获得的细菌菌株在LB固体培养基上划线，挑取单菌落放入装有LB液体培养基的10 mL离心管中，28℃、180 r/min摇培24 h。采用细菌基因组DNA提取试剂盒，参考使用说明书进行DNA提取，-20℃保存备用。利用16S通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3’)对菌株 16 S rDNA片段进行PCR扩增。PCR扩增体系25 μL：模板DNA 3 μL、dd H2O 7.5 μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL。反应条件为：94℃ 3 min，1个循环；94℃30 s，55℃ 1 min，72℃ 90 s，29个循环；72℃ 10 min，1个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送往华大基因科技股份有限公司进行测序，获得序列经NCBI数据库在线BLAST比对分析，并利用MEGA 7.0软件中的邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 不同细菌菌株发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性结果

不同细菌菌株发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性见表1。表1可知，34个细菌菌株发酵液处理马铃薯腐烂茎线虫48 h后，对该线虫均表现出一定的致死作用。其中菌株Chi9-7与Xia4-11发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的校正死亡率在80%以上，菌株Xia4-11发酵液对马铃薯腐烂茎线虫致死作用最强，校正死亡率达82.59%；菌株Nong3-5、Z-1、Gu4-7、b5-4、b1-3、Nong5-6和Chi9-2发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的校正死亡率为72.36%～77.94%，且不同菌株间触杀作用差异并不显著；另外菌株 X1''、Chitu8-4、Gen7-3、S-6、Gen9-3、Gen6-10和CF4-51发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的校正死亡率为60.53%～69.16%；其余菌株对马铃薯腐烂茎线虫的致死作用较差，校正死亡率均在24.49%～59.42%之间，其中菌株Chi1-15、3-6、C-11发酵液对马铃薯腐烂茎线虫正死亡率分别为仅为24.49%、27.04%、29.51%。

表1 不同菌株发酵液对马铃薯腐烂茎线虫48 h的触杀活性

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态鉴定 9个细菌菌株菌落形态见图1、表2。图1、表2可知，对马铃薯腐烂茎线虫校正死亡率大于72.36%的9个细菌菌株进行鉴定，9个菌株接种于LB固态培养基后，于34 h时观察各个菌株的具体形态特征及生长情况发现菌株Xia4-11、Chi9-2、b5-4、Nong3-5、Chi9-7和Z-1单菌落直径3～4 mm，Nong5-6、b1-3和Gu4-7单菌落直径7～8.6 mm，其中菌株Gu4-7生长速度最快34 h时8.6 mm，Nong5-6和b1-3生长速度较快，分别为7 mm和7.5 mm，其余菌株生长较慢菌落直径3～4 mm；9个菌株中Chi9-2菌落边缘形状为圆形，其余菌株均不规则；菌株Xia4-11、Chi9-2、Nong3-5、Nong5-6和Chi9-7的单菌落形态平滑，其余菌株但菌落形态隆起；菌株b1-3菌落颜色为乳白色，其余菌株颜色均为淡黄色；菌株Chi9-2、Z-1和Gu4-7菌株质地湿润，Nong3-5、Xia4-11、Nong5-6、Chi9-7菌株质地干燥，其余菌株质地粘稠；菌株Xia4-11和Z-1菌株气味分别为腥味和臭味，其余7个菌株均无味，如图1、表2所示。

图1 9个细菌菌株菌落形态

表2 9个细菌菌株菌落形态特征

2.2.2 生理生化特征鉴定 9个细菌菌株生理生化特征见表3。表3可知，在碳源利用上9个菌株均能够利用D-木糖、葡萄糖、蔗糖、D-山梨醇；除菌株Z-1和Gu4-7外，其余7个菌株均能利用L-阿拉伯糖；除菌株Gu4-7外，其余8个菌株均能利用i-肌醇；菌株b5-4、Nong5-6和Gu4-7不能利用水杨苷，但其余6株菌均能利用其生长；在氮源利用上，9个菌株均能够利用硝酸铵，除菌株b5-4外，其余8株菌均能利用硝酸钾；此外，淀粉水解、V-P测定、接触酶、硝酸盐还原、明胶液化、H2S产生、吲哚试验中9个株菌均为阳性。

表3 9个细菌菌株生理生化特征

2.2.3 16S rDNA分子鉴定 利用16S rDNA对筛选获得的9个细菌菌株进行分子鉴定结果见图2～3。由图2可知，PCR扩增得到的片段大小为1500 bp左右。由图3可知，菌株Chi9-7、Nong3-5、Nong5-6、b1-3与枯草芽胞杆菌Bacilluicssubtilis处于同一分支，Chi9-7、Nong3-5与B.subtilis（登录号：MT590663.1）相似性均为100%，Nong5-6与B.subtilis（登录号：KC1978.5.1）相似性为99.79%，b1-3与B.subtilis（登录号：MT487684.1）相似性为99.93%；b5-4菌株与贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis属于同一分支，相似性为100%；Chi9-2、Xia4-11、Gu4-7和Z-1与解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens属于同一分支，Chi9-2与B.amyloliquefaciens（登录号：MT613661.1）相似性 为100%，Xia4-11、Gu4-7和Z-1与B.amyloliquefaciens（登录号：KC417346.1）相似性分别为99.93%、99.72%和99.86%。

图2 9个细菌菌株16S rDNA的PCR扩增结果

图3 9个细菌菌株系统进化树

经细菌16S rDNA分子鉴定，并结合各菌株的形态特征和生理生化特性，将9个供试菌株分别鉴定为菌株Chi9-7、Nong3-5、Nong5-6和b1-3为枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，菌株Chi9-2、Xia4-11、Gu4-7和Z-1为解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)，菌株B5-4为贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensis)。

3 讨论与结论

芽胞杆菌(Bacillusspp.)作为重要的生防因子，广泛应用于农作物的病害防控，是当前的研究热点[23]，已在植物线虫病害的生物防治领域发挥着重要作用。近年来，研究人员筛选出多个解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株对植物线虫具有较高的抑制活性。例如，蒋盼盼等[24]室内研究发现，解淀粉芽胞杆菌菌株B1619粗提液原液分别处理蔬菜根结线虫，其24、48 h的线虫死亡率分别达78.8481%和82.4923%。Zhu等[25]研究发现解淀粉芽胞杆菌JK-JS3培养原液滤液对松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、李氏长尾线虫、吴氏长尾线虫和外滑刃科线虫共7种侵染松树的植物线虫具有一定杀线活性；在此基础上，朱丽梅等[26]对解淀粉芽胞杆菌JK-JS3分泌的杀线虫活性物质进行了研究，发现该物质在碱性条件下杀线活性较高，且在常温25℃和冷藏4℃条件下保存60天后仍具有较高的杀线活性。结合前人的研究结果表明，解淀粉芽胞杆菌对于多种植物线虫均具有较强的杀线活性。但是，对于马铃薯腐烂茎线虫，往往比其他植物线虫具有更高的抗逆性[27]。因此，筛选出对马铃薯腐烂茎线虫具有高效抑制活性的生防菌株难度较大。夏彦飞[28]研究发现解淀粉芽胞杆菌FZB42和B3培养滤液处理马铃薯腐烂茎线虫48 h的抑制率分别达到28%和65%；而本研究筛选出4株解淀粉芽胞杆菌Xia4-11、Chi9-2、Gu4-7和Z-1，具有更强的触杀活性，对马铃薯腐烂茎线虫48 h的抑制率达到73.28%～82.59%。一般来说，理想的生防微生物除了要具有较高的抑病活性，在田间环境中的定殖能力往往影响其生防效果，因此今后有必要将继续开展田间试验，从而进一步筛选获得更具开发潜力和应用前景的生防菌株。

研究表明，枯草芽胞杆菌B.subtilis也对多种植物线虫具有较高的抑制活性。如夏彦飞等[29]发现，枯草芽胞杆菌OKB105发酵液处理南方根结线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫和程氏伞滑刃线虫，4种线虫24 h的死亡率均达到100%。陶树兴等[30]通过盆栽试验发现，枯草芽胞杆菌2-3-2发酵液对黄瓜根结线虫病防效达89.41%，且明显增加植株干重。丁国春等[31]研究发现，枯草芽胞杆菌AR11稀释菌悬液对南方根结线虫的二龄幼虫有抑制作用，且高浓度菌悬液可以强烈抑制卵的孵化，同时对番茄具有明显的促生作用。对于马铃薯腐烂茎线虫，刘玮玮[32]研究发现枯草芽胞杆菌BL02和G8产生的挥发物能够对该线虫产生强烈的抑制作用，经菌株挥发物处理后大部分线虫在1～12 h内活动逐渐减弱，24 h后完全停止活动。本研究利用直接触杀的测定方法，发现枯草芽胞杆菌Chi9-7、Nong5-6、b1-3和Nong3-5发酵液对马铃薯腐烂茎线虫具有明显的抑制活性，48 h抑制率可达到72.36%～80.02%；但在试验过程中这些菌株是否产生挥发性物质并对该线虫产生熏蒸活性，还有待于后续试验的验证。

贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis是一种新型的生防因子，具有广谱抑菌活性和促进植物生长的作用，在农业生产中极具开发潜力[33]。张文博等[34]研究发现贝莱斯芽胞杆菌FZB42稀释培养液处理松材线虫48 h的抑制率达50%。茆振川等[35]研究发现贝莱斯芽胞杆菌Bv-25对根结线虫病具有良好的防治效果，利用该菌株进行病害的早期防控，从而有助于实现蔬菜的安全和无公害生产。针对于马铃薯腐烂茎线虫，之前尚未检索到具有较高抑制活性的贝莱斯芽胞杆菌菌株；而本研究筛选了一株贝莱斯芽胞杆菌b5-4，对马铃薯腐烂茎线虫具有较强的触杀效果，48 h时线虫的校正死亡率达76.52%，这一发现填补了相关领域的空白。生防微生物资源十分丰富，蕴藏其中的代谢产物可以为新型杀线剂的研发提供新的思路。作为新型生防因子，贝莱斯芽胞杆菌b5-4抑制马铃薯腐烂茎线虫的机制有待于深入研究。

本研究以马铃薯腐烂茎线虫为靶标，从34个细菌菌株中筛选出9株芽胞杆菌，表现出较高的触杀活性，其48 h的抑制率达到72.36%～82.59%；进而利用16S rDNA基因，并结合菌落形态和生理生化特征，鉴定出4株解淀粉芽胞杆菌、4株枯草芽胞杆菌和1株贝莱斯芽胞杆菌。本研究通过筛选高效杀线虫生防菌，为微生物杀线剂的研发提供了新资源，也为马铃薯腐烂茎线虫病的有效防控奠定了基础。