北京、河北、山东黄瓜穴盘商品苗壮苗指数及霜霉病快速抽样检测研究

赵立群，田雅楠，曹玲玲，曹彩红

（北京市农业技术推广站，北京 100029）

0 引言

自2008年集约化育苗成为国内农业主管部门主推技术以来，蔬菜集约化育苗产业蓬勃发展，常年生产的蔬菜约2/3采用育苗移栽[1]，对种苗的需求量约为6800亿～7300亿株，而目前全国集约化育苗供苗量仅约1000亿株，市场前景仍然十分广阔[2]。其中，黄瓜是采用育苗移栽生产最主要的蔬菜种类之一，以寿光为例，黄瓜种苗可占到育苗总量的20%[3]。

对于黄瓜穴盘成品苗质量的评价，业内生产者和用苗户之间普遍采用描述性标准（如株高、茎粗、生理苗龄等）作为交货约定，农业主管部门在2010年之后陆续出台的一系列穴盘育苗标准中，也主要采用了上述方法，采用目测方法，对黄瓜成苗形态（株高、茎粗、叶色、生理苗龄、盘根情况等）、病虫害和机械损伤等指标进行规定，作为成苗或壮苗质量标准[4-5]。但在实际生产中，当用苗户与育苗场之间就种苗品种纯度、壮苗比例、种苗带病等问题发生纠纷时，由于一般采用上述经验性的成苗指标，双方很难提供定性依据，严重影响菜农经济效益和育苗企业的信誉[6-7]，也不利于育苗产业和蔬菜产业的优质安全高质量发展。

北京和济南地区育苗场的生产调研发现，霜霉病是黄瓜集约化育苗需要防治的最主要病害之一，由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)引起，设施内可周年发生危害[8]，在苗期和成株期均可发病，即使苗期不发病也可能由于幼苗带病对后期栽培造成严重影响[9]。

笔者从北京、河北、山东的集约化育苗场抽样采集肉眼所见为健壮且无病虫害的黄瓜穴盘成苗样品70份，测算其株高、茎粗、干/鲜质量和壮苗指数等生理指标，并通过PCR技术对其进行黄瓜霜霉病的带菌情况检测，旨在探索黄瓜集约化穴盘商品成苗质量快速检测方法，以期为商品苗成苗质量评价及苗期病害及早隔离防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验样品于2018年分别在北京大兴、顺义、通州、昌平、房山地区，河北曲周、定兴地区及山东济南共8地的14家集约化育苗场中采集，按照《蔬菜穴盘育苗通则》(NY/T 2119—2012)中的成品苗要求，随机抽样采集肉眼所见为健壮且无病虫害的黄瓜穴盘成品苗70株，按照1～14号育苗场进行顺序编号，每个育苗场采集5份样品，单株封于自封袋内，按照“n号育苗场-第n株”进行标记，样品于次日在实验室内进行各项生理指标和霜霉病检测。

1.2 试验方法

1.2.1 生理指标检测 株高用直尺测量基质表面到幼苗生长点的高度；茎粗用游标卡尺测量幼苗茎基部上方1 cm处；将根部清洗除尽基质后吸干水分，与地上部鲜质量分别用1/1000天平称量；在通风干燥箱105℃下杀青30 min，80℃烘至恒重，再用1/1000天平分别称量干质量。每份样品每个指标测量3次重复后取平均值。

1.2.2 霜霉病检测

（1）按照Quick DNA Isolation Kit（快速提取DNA试剂盒）说明书提取DNA，提取物为黄瓜全基因组DNA和黄瓜叶面附着菌DNA混合液。提取的DNA溶解于TE缓冲液中，测定DNA浓度并稀释至10～20 ng/μL待用。

（2）根据黄瓜霜霉病病原菌古巴假霜霉菌病原菌DNA内转录间隔区ITS设计的通用引物进行霜霉病检测[10]，目标扩增产物长度为650 bp，具体引物名称及序列见表1。

表1 PCR引物名称及序列

（3）利用高通量PCR技术扩增目标条带，PCR反应结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 20软件及Excel 2016软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄瓜穴盘苗采样情况

试验共抽样采集样品70份，品种均为当地实际采用订单式销售的华北型黄瓜，其中大兴20份、顺义10份、通州15份、昌平5份、房山5份、曲周5份、定兴5份、济南5份。黄瓜秧苗均为集约化方式生产，采用50孔穴盘，生理苗龄1～4叶1心。

2.2 黄瓜穴盘苗生理指标比较

对采集的70份样品进行生理苗龄、株高、茎粗、地上部鲜重、地上部干重、根鲜重、根干重、壮苗指数等指标的测算，并按照每育苗场取平均值。结果（表2）表明，各育苗场间黄瓜成苗平均壮苗指数相差较大，最大值0.196来自通州的9号育苗场，最小值0.017为来自大兴的2号育苗场，但两者生理苗龄差别较大，前者为4叶1心，后者为1叶1心。

本试验对壮苗指数与表2中各项生理指标的相关性分析（图1）表明，根干重与壮苗指数的相关系数最大，达到0.995，呈显著正相关，说明根干重是黄瓜穴盘成苗壮苗指数大小的决定因素，可用于快速评测黄瓜种苗质量。

图1 各项生理指标相关性分析结果

表2 北京、河北、山东部分育苗场黄瓜穴盘苗平均生理指标

2.3 霜霉病检出情况

对采集的70份样品进行黄瓜霜霉病病原菌目标条带的PCR扩增，结果（图2）表明，3号育苗场的第5株、5号育苗场的第1株、7号育苗场的第5株、8号育苗场的第2～5株、9号育苗场的全部5株、10号育苗场的第2～5株、11号育苗场的第1～3株、12号育苗场的第1～3、5株、13号育苗场的第1～2、4～5株和14号育苗场的第4株样品扩增出约为650 bp的目标条带，提示叶片含有霜霉病病原菌。

图2 部分样品霜霉病PCR检测结果

2.4 生理与病害试验结果汇总分析

70份样品进行的幼苗质量相关生理指标和霜霉病带菌情况检测结果（表3）表明，北京地区采集的55株样品中，单株壮苗指数最大值达到0.256，最小值仅为0.005，平均壮苗指数0.078，霜霉病检出率34.55%。河北地区采集的10份样品中，单株壮苗指数最大值为0.132，最小值为0.053，平均壮苗指数0.079，霜霉病检出率80.00%。山东地区采集的5份样品中，单株壮苗指数最大值为0.117，最小值为0.086，平均壮苗指数0.101，霜霉病检出率20.00%。

表3 北京、河北、山东部分育苗场黄瓜穴盘苗壮苗指数与霜霉病检测情况

3 结论与讨论

3.1 黄瓜穴盘苗壮苗指数结果评价

国内目前育苗场在实际生产和现行黄瓜穴盘苗生产标准中，一般通过目测外观形态和有无病虫害来评判黄瓜穴盘苗质量，主要依靠经验，人为误差较大。相比之下，文献报道中对黄瓜种苗的质量评价更为量化和准确，主要通过测定生理指标对种苗质量进行评价，包括形态生理指标（株高、茎粗、叶面积、地上部/根部干重、地上部/根部鲜重、根冠比、G值、壮苗指数等）[11-17]及代谢生理指标（代谢酶活性、根系活力、叶绿素含量、光合速率等）[18-21]。虽然不同文献的检测指标及侧重不同，但一般均将壮苗指数作为种苗评价的基本指标。本试验通过对北京、河北、山东等黄瓜主产区育苗场随机抽取的70份穴盘商品苗进行生理指标测定分析，获得了一系列黄瓜幼苗质量量化数据。结果显示，由于生产习惯和供应茬口等原因，各育苗场黄瓜成苗的生理苗龄从1叶1心至4叶1心不等，而且壮苗指数相差较大，但经过相关性分析发现，70份黄瓜种苗的根干重与壮苗指数的相关系数达到0.995，且呈显著正相关，表明根干重可以代替壮苗指数定性评价黄瓜穴盘苗质量，用于快速评测黄瓜种苗生理质量，提高评价效率。

3.2 黄瓜穴盘苗霜霉病检测结果评价

随着集约化育苗产业的不断发展壮大，大型集约化育苗企业生产的商品苗多销往周边多个省市甚至全国，这也使种苗带病在地区间传播成为可能，北京地区首次报道发现番茄黄化曲叶病毒病即是由种植户购买的山东种苗带病[22]传播所致。传统的生物学病害检测方法基于田间显性症状观察和病菌分离测定，若处于潜育期的霜霉病叶片不表现症状，叶片内病原菌含量太低，则检测耗时较长，待显症后已造成损失，不利于病害的预测和防控[23-24]。黄瓜霜霉病属于真菌性病害，已有研究表明，真菌rDNA的内转录间隔区ITS区段既具保守性，在科、属、种水平上均有特异性序列，有利于低浓度或被高度降解的DNA样品中ITS区域的扩增，常用作分子鉴定、诊断和检测植物病原菌的靶序列[25-26]。本试验建立的检测方法，利用霜霉病核糖体基因ITS区段设计特异引物进行PCR扩增，从肉眼所见不发病的健壮幼苗样品中检测到叶片携带霜霉病病菌，且在北京、河北、山东均有检出，其中河北地区检出率高达80%，表明霜霉病是显著影响国内黄瓜种苗生产和交易的重要病害，PCR技术可对黄瓜种苗霜霉病等苗期病害进行快速精准的早期鉴定，对进行种苗健康质量评价具有重要的指导意义。同时，通过PCR技术进行苗期病害预测还可以及时开展病害科学防治，有效防止病害传播和蔓延。

笔者对北京、河北、山东黄瓜穴盘商品苗进行抽样，结合壮苗生理指标测量和病害PCR检测技术，快速精准评价了秧苗质量，可为黄瓜商品苗质量控制和质量评价提供依据，同时为其他蔬菜种苗质量评价提供参考。