虞冰,刘莉,吾建祥,杨德毅,马婧妤
(金华市农产品质量安全中心,浙江 金华 321017)
氟喹诺酮类药物(FQs)是一类全合成广谱抗菌药,广泛用于人和动物的疾病治疗,具有高效、广谱、低毒等特点,在畜牧养殖业中广泛用于预防和治疗动物疾病[1-2]。FQs药物长期使用会于动物体内蓄积,影响到人类的健康,会对人体的心血管系统及中枢神经系统造成不良影响,可导致呼吸肌无力,重症肌无力,甚至危及生命[3]。动物性食品中低浓度的FQs残留易产生耐药性菌株,致使有效使用剂量增加。本文借鉴标准规定和相关文献的前处理方法[4-7],建立高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS),用于同时测定水产品中15种FQs残留,在试样的提取、高效液相色谱和质谱的检测条件方面进行优化,旨在为氟喹诺酮类兽药残留检测提供参考。
水产品(鲫鱼)采购于金华市各地市养殖企业。98.48%氟罗沙星、95.71%氧氟沙星、97.49%诺氟沙星、97.51%依诺沙星、92.31%环丙沙星、99.90%恩诺沙星、99.42%洛美沙星、99.90%丹诺沙星、97.50%奥比沙星、96.80%双氟沙星、85.92%沙拉沙星、99.00%司帕沙星、98.20%噁喹酸、99.30%氟甲喹、92.19%培氟沙星均为标准品(北京振翔科技有限公司);无水硫酸钠、正己烷均为分析纯;乙腈、甲酸为色谱纯。试验用水(一级水,电阻率为17.65 MΩ·cm)
LC-MS/MS8050超高效液相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司);高速离心机(日本日立公司);BSA2202S电子天平(德国赛多利斯公司);BSA224S电子天平(德国赛多利斯公司);涡旋振荡器(德国IKA);均质器(新锐精仪);旋转蒸发仪(Heidolph);台式离心机(上海安亭)。
1.2.1 色谱条件
色谱柱为C18柱,MGⅡ,2.1 mm×150 mm,5 μm,或相当者;流动相A相为0.1%甲酸溶液(含5.0 mmol·L-1醋酸铵),B相为甲醇,C相为乙腈;流速为0.20 mL·min-1;柱温为室温;进样量10 μL;洗脱方式为梯度洗脱。梯度洗脱条件见表1。
表1 液相色谱流动相洗脱条件
1.2.2 质谱条件
离子化模式为电喷雾离子源(ESI)、正离子模式;喷雾电压为4 500 V;雾化气压力为12 L·min-1;辅助气流量为2 L·min-1;离子传输管温度350 ℃;源内碰撞诱导解离电压为10 V;扫描模式:选择反应监测(SRM),选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量(表2)。
表2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量
1.2.3 储备液配制
称取99.90%恩诺沙星、99.90%丹诺沙星各10.01 mg,98.48%氟罗沙星10.15 mg,95.71%氧氟沙星10.45 mg,97.49%诺氟沙星10.26 mg,97.51%依诺沙星10.26 mg,92.31%环丙沙星10.83 mg,99.42%洛美沙星10.06 mg,97.50%奥比沙星10.26 mg,96.80%双氟沙星10.33 mg,85.92%沙拉沙星11.64 mg,99.00%司帕沙星10.10 mg,98.20%噁喹酸10.18 mg,99.30%氟甲喹10.07 mg,92.19%培氟沙星10.85 mg。
1.2.4 样品前处理
称取(5±0.02)g试样,于50 mL具塞离心管中。加入5 g无水硫酸钠,加入钢珠,再加入20 mL乙腈,放入均质器内匀浆。以4 000 r·min-110 ℃离心5 min,取上清液于50 mL梨形瓶中。残渣中再加入20 mL乙腈,重复提取1次,合并2次提取液。在梨形瓶中加入5 mL异丙醇,用旋转蒸发仪于50 ℃水浴浓缩蒸发至干。准确加入2 mL流动相(甲醇∶水=1∶1),再将梨形瓶进行超声溶解残渣,将混合液转移至5 mL离心管中,加2 mL正己烷至梨形瓶中,超声溶解,转移至上述离心管。将5 mL离心管中的混合液涡旋,以4 000 r·min-1离心5 min,去上层液体。如果试样分层不明显,油脂浑浊,再加1 mL正己烷,重复净化,直至下层液体澄清。取下层清液,过0.2 μm滤膜,装入进样瓶,并在进样瓶上写上编号,用液相色谱-串联质谱仪测定。
1.2.5 计算与表述
计算氟喹诺酮类兽药残留量公式:
Xi=ciV/m。
式中,Xi为样品中喹诺酮类药物残留的含量(μg·kg-1);ci为样品制备液中氟喹诺酮类药物残留的浓度(ng·mL-1);V为最终定容体积(mL);m为样品称样量(g)。保留3位有效数字。
取适量的标注储备液,用流动相初始溶液对15种氟喹诺酮类药物标准储备液进行稀释,形成系列浓度为2、5、10、20、50、80 ng·mL-1的标准工作溶液。浓度从低到高依次进样测定,每个浓度进样3次。以离子色谱峰面积为纵坐标、相应的溶液浓度为横坐标作图,得到相应氟喹诺酮类药物的标准曲线。15种氟喹诺酮类药物在5~80 ng·mL-1浓度范围内,呈良好线性关系,线性回归方程、相关系数见表3。
表3 15种氟喹诺酮类药物标准曲线及相关系数
将适量的标准工作溶液加到空白试样中,按照1.2.4节的试验方法处理以后,用UPLC-MS/MS进行检测。通过计算本试验方法,检出限(LOD,S/N>3)为1.0 μg·kg-1,定量限(LOQ,S/N>10)为2.0 μg·kg-1。
量取20、100、200 μL对照工作液加到5 g样品中,添加浓度3个平行,每份样品测定3次,取平均值,计算回收率和相对标准偏差(RSD)。由表4可知,试样中15种氟喹诺酮类兽药添加样品的回收率在77.33%~100.30%之间。回收率和RSD均达到良好要求。
表4 禽蛋中8中氟喹诺酮类兽药回收率和标准偏差
本文建立了水产品中15种氟喹诺酮类兽药残留检测的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定方法,该方法与普通液相色谱法相比,定性定量更准确,检测速度提升,分离时间缩短,方法的灵敏度和分离度及重现性较好,稳定性高,满足水产品中氟喹诺酮类药物残留分析的检测要求,同时溶剂用量大为减少,降低了分析成本,使检测效率得到提升,可以用来监控水产品中15种氟喹诺酮类药物的残留量。