双黄连吸入溶液UPLC指纹图谱及含量测定研究

尹睿卓 1,3，胡杰 2，王慧阳 1,3，周舟 1,3，马新称 1,3，邓远锋 1,3，王雪花 1,3，李翠

[1.盈科瑞（横琴）药物研究院有限公司，广东珠海 519000；2.北京盈科瑞创新医药股份有限公司，北京 10000；3.广东省雾化吸入制剂工程技术研究中心，广东珠海 519000；4.暨南大学，广东广州 510632]

双黄连吸入溶液由我国已上市的双黄连注射液的基础上改良开发而成，含金银花、黄芩、连翘3味中药。双黄连制剂临床应用广泛，具有疏风解表、清热解毒之功效，可用于治疗病毒及细菌感染所致的感冒、发热、咳嗽等疾病，并对新型冠状病有一定潜在的治疗作用[1-4]。

双黄连吸入溶液采用雾化吸入方式给药，可通过吸入给药途径而增加呼吸道的药物浓度和药效维持时间，从而提高其疗效，吸入给药使药物进入全身血循环的药物浓度大幅度降低，可较大程度的避免注射剂因为静脉给药而造成的严重不良反应，降低了相对于注射剂的安全性担忧[5-6]。

目前，双黄连吸入溶液处于临床前研究阶段，本研究首次采用超高效液相-双波长检测法建立了双黄连吸入溶液中酚酸、黄酮、木脂素、苯乙醇苷类成分的指纹图谱，确定了17个共有指纹峰；并对绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸及连翘苷的含量进行测定。该方法相对全面地反映了双黄连吸入溶液中药效组分的种类、数量及含量特征。

1 仪器与试药

安捷伦1290 InfinityⅡ超高液相液相色谱仪：配备二极管阵列检测器，Open-LAB工作站（美国安捷伦公司）；SQP型（十万分之一）电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；Master-s15型纯水机（上海和泰仪器有限公司）。

双黄连吸入溶液，批号：CP-200527-02（S2）、CP-200707-02（S3）、CP-200715-01（S4）、CP-200716-01（S5）、CP-200717-01（S6）、CP-200722-07（S7）、CP-201025-01（S8）、CP-201210-01（S9）、CP-201210-02（S10）、CP-201210-03（S11），由盈科瑞（横琴）药物研究院生产。新绿原酸对照品（批号：DST200521-015，质量分数：97.6%）、隐绿原酸对照品（批号：DST200521-035，质量分数：97.5%）购自成都乐美天医药德思特生物有限公司。异绿原酸B对照品（批号：000319-201912，质量分数：98.3%）购自江西佰草源生物有限公司。绿原酸对照品（批号：110753-201817，质量分数：96.8%）、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品（批号：111782-201807，质量分数：94.3%）、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品（批号：111894-201102，质量分数：94.1%）、连翘苷对照品（批号：110821-201816，质量分数：95.1%）购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Welch Ultimate®UHPLC XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8µm）；以乙腈为流动相A，以0.4%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～1 min，7%～10%A；1～3.5 min，10%～11%A；3.5～5 min，11%～14%A；5～10 min，14%～15%A；10～16 min，15%～17%A；16～19 min，17%～25%A；19～30 min，25%A）；指纹图谱及连翘苷测定检测波长为210 nm，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸测定检测波长为324 nm；柱温为30℃；流速为0.3 mL/min；进样量为2μL。

2.2 对照品溶液的制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，摇匀，即得，作为指纹图谱用对照品溶液。取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含新绿原酸15μg、绿原酸12μg、隐绿原酸12μg、异绿原酸B6μg、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸3μg、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸6μg、连翘苷15μg的混合对照品溶液，摇匀，即得，作为含量测定用混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加50%（体积分数，下同）甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液（S8），按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，以黄芩苷为参照物，计算各共有峰的相对保留时间RSD值均小于5%，相对峰面积RSD值均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批样品6份（S8），按“2.3”项制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，以黄芩苷为参照物，计算各共有峰的相对保留时间RSD值均小于5%，相对峰面积RSD值均小于5%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（S8），按“2.3”项方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、36 h按“2.1”项色谱条件测定，以黄芩苷为参照物，计算各共有峰的相对保留时间RSD值均小于5%，相对峰面积RSD值均小于5%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.4.4 指纹图谱的建立及共有峰的标定 取10批双黄连吸入溶液，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，将10批双黄连吸入溶液色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”进行分析，采用中位数法（设置时间窗口宽度为0.1）对色谱峰进行自动匹配，形成共有模式图，生成对照指纹图谱（编号R），共得到17个共有峰，指纹图谱叠加图见图1，对照指纹图谱见图2；相似度均大于0.90，符合相关要求，见表1。

表1 10批双黄连吸入溶液指纹图谱相似度比较结果Table 1 Results of similarity tests of 10 batches of Shuang‐huanglian solution for inhalation

图1 10批双黄连吸入溶液UPLC指纹图谱叠加图Figure 1 UPLC fingerprints of 10 batches of Shuang‐huanglian solution for inhalation

2.5 7种活性成分质量浓度的测定

2.5.1 专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪进行测定，色谱图见图3。

图3 混合对照品及供试品色谱图Figure 3 The chromatograms of mixed reference and samples

2.5.2 线性范围考察 精密吸取“2.2”项混合对照品溶液0.25、0.5、1、2、3、5、6μL注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2，表明各化合物在相应范围内线性关系良好。

表2 7种成分的线性考察结果Table 2 The results of the linear relationship of seven components(n=2)

2.5.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2μL，连续进样6次，按“2.1”项色谱条件测定，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷峰面积RSD值分别为0.58%、0.50%、0.52%、0.27%、0.15%、0.10%、0.34%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷平均质量浓度分别为0.686 4、0.652 2、0.706 9、0.357 1、0.128 2、0.308 2、0.663 7 mg/mL，其RSD值分别为1.22%、1.26%、1.29%、1.17%、1.09%、1.16%、1.32%，表明方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取“2.3”项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、36 h按“2.1”项色谱条件测定，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷峰面积RSD值分别为0.64%、0.20%、0.31%、0.25%、0.92%、0.43%、0.90%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.5.6 回收率试验 精密量取取同一批样品6份（S8），每份0.5 mL，精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液适量，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷平均加样回收率分别为97.08%、99.91%、100.9%、102.5%、93.96%、103.4%、100.7%，见表3，表明方法准确度良好。

表3 (续)

表3 7种成分的加样回收率试验结果Table 3 The recoveries of seven components in Shuanghuanglian solution for inhalation(n=6)

2.5.7 样品测定 取10批双黄连吸入溶液成品，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定[7-9]。结果测得10批双黄连吸入溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷平均质量浓度分别为0.76、0.65、0.69、0.31、0.10、0.27、0.67 mg/mL，结果见表4。

表4 10批双黄连吸入溶液质量浓度测定结果Table 4 The determination results of 10 batchesof Shuanghuanglian solution for inhalation(n=2) ρ/（mg·mL-1）

3 讨论

双黄连吸入溶液含有金银花、黄芩、连翘3味中药，其中金银花中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸为酚酸类成分，连翘中连翘苷为木脂素类成分，均具有抗感染、抗菌、抗病毒等作用，故选作为含量测定指标[10-11]。黄芩中的黄芩苷为黄酮类成分，色谱峰响应值较大，分离度较好，故将黄芩苷作为指纹图谱参照峰。

本研究考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇3种供试品溶媒，结果不同溶媒处理的样品含量测定结果差异不大，但采用50%甲醇处理的供试品溶液的色谱峰峰形更好，故选取50%甲醇作为供试品溶媒。同时又考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-0.4%磷酸水4种流动相，结果乙腈-0.4%磷酸流动相系统基线平稳且分离效果较好。

目前，双黄连制剂中多采用260～350 nm波段作指纹图谱检测波长[12-15]，而连翘和金银花中部分化合物在210 nm波长左右有较强末端吸收。本研究分别考察对比了210、230、250、310、324、350 nm检测波长色谱图，结果显示210 nm波长下各色谱峰分离较好、信息量较多；连翘苷在210 nm波长下长色谱峰响应值较大，专属性与分离度较好，并可以与指纹图谱测定相结合，故选择210 nm作为指纹图谱及连翘苷含量的检测波长；324 nm波长下新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸响应值最大，各色谱峰分离较好，故选择324 nm作为酚酸类成分的检测波长。

本研究建立了双黄连吸入溶液210 nm波长下的UPLC指纹图谱，并采用双波长检测法对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷7种成分的质量浓度进行同时测定，该方法节省了分析时间并保证采集信息量的最大化，可为双黄连吸入溶液的质量控制及后续药效学评价提供参考。