柳州地区部分孕产妇B族链球菌的耐药性与分子特征分析

陈燕群 1,陈继昌 2,吴宇碧

（柳州市妇幼保健院 1.检验科；2.新生儿科；3.产科，广西柳州 545001）

B族链球菌（group BStreptococcus，GBS）在正常情况下可定植于孕产妇的生殖道，约10%的孕产妇生殖道可检出GBS[1]。GBS是一种机会性病原体，可在分娩前或分娩时通过垂直传播感染新生儿，导致发生早发型GBS感染（early-onset group B streptococcus，EOGBS）等，此类感染与新生儿的感染性疾病发病率与死亡率高度相关[2⁃3]。产前抗生素预防（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）对新生儿的管理非常重要，因而需要对产前GBS阳性菌株进行抗菌药物敏感性试验以选择敏感药物进行预防性用药[2]。此外，GBS拥有大量毒力因子，可附着于宿主细胞，从而导致宿主发生侵袭或定植，从而导致疾病进一步进展[3⁃4]。为全面了解本地区从孕产妇样本分离的GBS菌株抗菌药物敏感性、毒力基因和耐药基因的分布情况，我院对分离的96株菌株进行了相关的流行病学调查和实验室检测，现将结果报告如下。

1 研究方法

1.1 研究人群和样本收集

收集2019年1月‒8月在我院分娩的、分娩前2周内无抗菌药物使用情况，且无发生急性、明显性感染孕产妇1 452名，纳入和排除标准参照文献[5]的标准进行。在分娩前，采集阴道分泌物，半小时内送至检验科微生物室进行处理。上述样本监测和采集的过程，获得柳州市妇幼保健院伦理委员会的批准，批文为（20170010）。

1.2 GBS的分离鉴定

将阴道分泌物拭子转种至GBS显色鉴定培养基中，在35～37℃的培养箱中培养18～24 h，将显色阳性的菌落（经显色后出现红色、粉红色或浅紫色）经进一步的革兰染色和过氧化氢酶实验确定为可疑阳性后，转种至哥伦比亚羊血培养皿中进行CAMP试验，观察溶血环状态，鉴定分离株为GBS后行抗菌药物敏感性试验和分子生物学分析。

1.3 抗菌药物敏感性试验

取阳性纯培养菌落，使用微量稀释法试验对GBS菌株进行药物敏感性分析，按照卡片的说明书操作进行。折点的判读基于美国临床与实验室标准化委员会提供的判读标准进行判读。对于青霉素耐药菌株，进一步使用E-tes t方法进行复核。抗菌药物多重耐药（multidrug resistance，MDR）的判定标准为对≥3种不同种类的抗菌药物同时产生耐药[6]。

1.4 耐药基因和毒力基因检测

取纯培养菌落，提取DNA后，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法检测大环内酯类、四环素类和林可酰胺类抗菌药物的耐药基因：ermA、ermB、ermTR、mefA/E、tetM、tetO、tetL、tetK、tetT、tetS和linB。采用PCR方法检测GBS的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsilon），耐药基因和毒力基因检测的方法和试剂盒的使用均参照文献[7]进行。

1.5 实验试剂及仪器

GBS显色鉴定培养基和哥伦比亚羊血培养皿均购自郑州安图生物工程股份有限公司，规格为90 mm。菌株药敏实验仪器选择法国梅里埃的VITEK COMPACT 2，药敏卡片选择GP67卡。

1.6 统计学分析

采用IBMSPSS 23.0软件对数据进行分析，连续型数据用x±s表示，采用t检验进行分析。计数资料和率的差异采用χ2检验或Fisher’s精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕产妇GBS定植的临床特征分析

本研究最终纳入了1 452名孕产妇检测GBS，检出96株GBS菌株，其阴道携带率为6.6%。在GBS检出的阳性妇女群体，低分娩孕周与孕产妇妊娠合并症/不良妊娠结局有关（P=0.004），见表1。

表1 孕产妇GBS定植的临床特征分析Table 1 Analysis of clinical characteristics of GBSisolated in pregnant women[n(%)]

2.2 孕产妇GBS菌株的血清型与耐药、毒力基因之间的关系分析

96例GBS菌株，共检测出3种血清型，分别为Ⅰa（41.7%）、Ⅰb（22.9%）和Ⅲ型（35.4%）。GBS多重耐药率为86.5%，菌株抗菌药物耐药率最高者为红霉素（99.0%）、克林霉素（96.9%）、四环素（86.5%）和左氧氟沙星（65.6%），主要的耐药模式为：红霉素⁃克林霉素⁃四环素、红霉素⁃克林霉素⁃四环素⁃左氧氟沙星、红霉素⁃克林霉素⁃四环素⁃氯霉素、红霉素⁃克林霉素⁃氯霉素等4种。其中氯霉素的耐药率在3种血清型中的分布存在显著差异，以Ⅰb型的耐药率为最高（P=0.017）。alphaC基因在血清Ⅰa型菌株的阳性率最高（P<0.001），rib基因在血清型Ⅲ的菌株中阳性率最高（P<0.001），epsilon基因在血清型Ⅰb的菌株阳性率最高（P=0.015，具体见表2。

表2 孕产妇GBS菌株的血清型与耐药、毒力基因之间的关系分析Table 2 Analysis of the relationship between the serotypes,drug resistance and virulence genes of GBSstrains isolated in pregnant women[n(%)]

2.3 GBS菌株血清型与毒力基因的对应分析

对应分析结果显示，GBS菌株的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsi‐lon基因）检出率与血清型分布存在差异性（χ2=56.78，P<0.001）。表现为血清型Ⅲ菌株更容易携带毒力基因rib，血清型Ⅰa菌株更容易携带毒力基因alphaC，血清型Ⅰb菌株更容易携带毒力基因epsi‐lon，见图1。

图1 GBS菌株血清型与毒力基因分布的对应分析Figure 1 Correspondence analysis of GBS strain serotypes and virulence gene distribution

3 讨论

GBS是新生儿疾病发生和死亡的主要致病原因之一，尤其在出生后的1周内[8]。全球范围内每年至少有350万早产发生的主要原因可归因于母亲GBS感染/定植。在中低收入国家，报告的GBS发病率数据更容易产生报告偏倚/发表偏倚。在亚洲，这个数据更是被严重低估。在一个成本效益建模报告中，披露的数据表明，亚洲EOGBS发病绝对数很高，但母亲GBS定植率较低，表明疾病的发病率被严重低估。文献指出，这些差异有可能是因为在该地区流行的GBS菌株毒力很可能有所不同。一些文献报道，与血清型Ⅲ密切相关的高毒力GBS菌株ST17既可能在孕产妇生殖道定植，也可能导致新生儿疾病的发生[8]。

IAP可预防每年3 000例新生儿的死亡[8]。本研究结果显示，96株GBS菌株药敏试验数据结果不乐观，有86.5%的菌株产生了多重耐药，最常见的耐药表型是红霉素⁃克林霉素⁃四环素和红霉素⁃克林霉素⁃四环素⁃左氧氟沙星。孕产妇中分离的GBS菌株对红霉素、克林霉素和四环素的高耐药率在国内也多次被报道[9⁃10]。国外研究显示，GBS菌株对四环素的耐药率高达94.9%[11]。且有15%的菌株对青霉素产生了耐药性[11]，且菌株对β内酰胺类抗菌药物的敏感性正在下降[12]。该研究发现从孕产妇阴道分泌物中分离出的GBS菌株中有30.8%对万古霉素产生了耐药性，且特定的血清型别与青霉素、万古霉素的耐药性存在高度相关性，如血清型别Ⅱ、V对青霉素的耐药性分别为33%和27%，而Ⅴ型对万古霉素的耐药率高达45%[11]。本研究结果显示，从孕产妇阴道分泌物样本中分离的GBS菌株对β内酰胺类抗菌药物均敏感，对利奈唑胺、万古霉素和替加环素等均100%敏感，表明上述药物仍可作为IAP的首选药物。临床使用抗菌药物对有高危因素需进行产前抗生素预防用药前，需进行皮试，对皮试结果阳性者，应使用敏感的抗菌药物，达到预防的效果。

本研究结果显示，在96株GBS菌株中，有57株菌株至少携带了1～3种大环内酯类耐药性的基因。高携带率的ermB和mefA/E的结果表明此两种耐药基因可能是GBS对红霉素产生耐药性的主要原因之一。已有多篇文献报道了诱导型大环内酯⁃林可酰胺⁃链霉菌素B（iMLSB）菌株同时携带ermB和mefA/E[13]。且该文献结果显示，ermTR和iMLSB高度相关。与上述研究结果相似，本研究结果显示，40.6%（39/96）的菌株携带了ermB和mefA/E，且84.4%（81/96）的菌株表明GBS菌株的高耐药基因阳性，凸显了在日常工作中持续对四环素和红霉素耐药监测的必要性。

目前研制的疫苗中，若90%的母亲接种GBS疫苗有80%左右的有效率，可保护约108 000名胎儿或新生儿免于死亡[11]。对本地区分离的GBS菌株进行持续性监测，可快速得知本土流行菌株的血清型，且为日后研制GBS疫苗提供依据。本研究结果显示，本地流行的GBS菌株血清型只有3种，Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型（分别占41.7%、22.9%和35.4%），与国内华南地区的流行病学调查结果及与国外的研究不一致[9，11]，表明血清学分布具有地域性差异。正在研制的3联苗（Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ）血清覆盖率达到100%，凸显了早日引进该类疫苗到本地区进行接种的重要性。

已有较多文献报道了GBS菌株的毒力基因在不同的血清型别中的差异性[14]。对GBS菌株进行持续性的监测可得知菌株的进化程度和遗传背景差异性[15⁃17]。本研究针对常见的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsilon基因）进行检测，结果显示，GBS菌株对alp2/3、al‐phaC、rib和epsilon基因的携带率分别为3.1%、30.2%、32.3%和34.4%。且对应分析结果显示，菌株的血清型别与alp表面蛋白抗原相关基因存在高度相关性。alp表面蛋白抗原相关疫苗（alphaC和rib）和3联苗（alphaC、rib和epsilon）的覆盖率分别为62.5%和96.9%，表明本土流行菌株的毒力基因与三联苗覆盖率高度吻合，引进alp表面蛋白抗原相关三联苗亦可预防绝大多数GBS定植阳性的孕产妇通过垂直传播将菌株传染给新生儿，从而减少EOGBS和死胎死产等，其成本效益较好。

本研究对柳州地区围产期孕产妇阴道定植的GBS菌株进行了抗菌药物敏感性试验、红霉素和四环素耐药基因检测、菌株的血清分型，并对alp表面蛋白抗原相关基因进行了详细分析，发现本地流行的GBS菌株大多呈现多重耐药性，国际上正在研发的血清三联苗（Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ）和alp表面蛋白抗原相关三联苗的覆盖率分别达100%和96.9%。本研究结果表明，对本地区孕产妇进行持续性GBS筛查和监测的必要性，凸显了及时对分离的GBS菌株进行血清分型和相关毒力基因监测的重要性。