秦皮乙素对SKOV3细胞增殖、干样特性及凋亡的作用

王姣，裴丽鹏，徐斌，赵博，沈素岩

(北部战区总医院和平院区，辽宁沈阳 110000）

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其中以卵巢上皮癌较为多见且严重威胁女性健康［1］。目前卵巢癌的病因尚不明确，但已有研究报道卵巢癌的发生与遗传［2］、内分泌失调［3］等因素存在密切关联。由于卵巢位于盆腔深处，且体积较小，发生癌变时没有明显症状，因此卵巢癌隐匿性极强，导致患者耽误治疗时机［4］。针对卵巢癌的治疗手段仍然是以手术配合放化疗，但随着中医的发展，中西结合的治疗手段日益完善［5-6］。秦皮乙素（esculetin，Esc）又称为6，7二羟基香豆素，是香豆素的衍生物，其分子式为C9H6O4。近年来，Esc已被报道具有抗炎［7］、抗菌［8］、抗氧化［9］等多种生物活性作用。Esc具有较强的抗肿瘤作用，包括肺癌、结肠癌和胰腺癌等［10-12］，因此推测Esc对卵巢癌肿瘤同样能发挥出积极的抑癌作用。本研究旨在探究Esc对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡和肿瘤干细胞样特性的影响，以期为卵巢癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人卵巢癌SKOV3细胞系购买于中科院上海生科院细胞库。

1.2 试剂

Esc购自中国食品药品检定研究院（批号：110741-201708，纯度≥99.9%）；盐酸阿霉素购自汕头经济特区明治医药有限公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶和F12培养基购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）购于日本DOJINDO公司；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自上海碧云天生物技术研究所；Matrigel胶和Transwell小室购于Corning公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝公司；兔抗CD44、CD133、Oct4、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Acitn单克隆抗体购自英国Abcam公司。

1.3 主要仪器

1658001垂直电泳槽，购自美国Bio-Rad公司；Heracell 240i二氧化碳培养箱，购自美国Thermo公司；SIGMA 3K15离心机，购自美国Sigma公司；Epics·XL流式细胞仪，购自Beckman公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 将人卵巢癌SKOV3细胞株接种于含10%（φ）胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI 1640细胞培养液，培养于含5%（φ）CO2、37℃的恒温培养箱，每2天换液1次，待细胞状态稳定后，取对数生长期细胞进行后续试验。

1.4.2 CCK-8检测细胞增殖 调整SKOV3细胞密度调整至5×104个/mL，接种于96孔板内，每孔加100μL细胞悬液。采用随机数字表法将细胞随机分为不同药物处理组（0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、2、4、8、16μmol/L），共11个组，每组3个复孔。待细胞贴壁后，按分组加入对应剂量Esc处理细胞24 h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，避光温育4 h，于450 nm波长处用酶标仪测定吸光度（A）。

1.4.3 细胞处理及分组 根据“1.4.2 ”结果，计算Esc对SKOV3细胞IC50值，选择无显著毒性的0、0.2、0.4、0.8μmol/L剂量Esc和阿霉素0.5μmol/L处理SKOV3细胞，将细胞随机分为5组：Control组、Esc 0.2μmol/L组、Esc 0.4μmol/L组、Esc 0.8μmol/L组和ADM 0.5μmol/L组。

1.4.4 克隆形成试验 在培养皿中培养SKOV3细胞至大约30%汇合度，继续培养4 d，吹散为单个细胞，用6孔板培养，约500个细胞每孔，培养14 d，弃掉培养基，用乙醇固定30 min，接着用0.5%结晶紫染色，用去离子水漂洗晾干，形成肉眼可见克隆形成集落后，固定、染色后进行拍照、计数。

1.4.5 细胞成球试验 分别取各组SKOV3细胞各100个接种于超低吸附24孔板中，每孔100μL F12成球培养基，含10个活细胞，各铺10个复孔。静置培养14 d后倒置显微镜下观察成球直径和成球数目。

1.4.6 Western blot检测 收集各组细胞用BCA试剂盒进行总蛋白提取并测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品，在100℃条件下变性5 min。然后使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃条件下加入相应一抗（1∶1 000）并孵育过夜，清洗，然后在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 500），孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。以Actin作为内参，ImageJ软件统计灰度值。

1.4.7 JC-1检测线粒体膜电位 收集各组细胞，并将细胞密度调整至1×106个/mL，将各组细胞接种于6孔板后PBS清洗3次，孵育24 h，加入JC-1（5μg/mL）室温避光反应30 min。用流式分选仪检测，记录红色和绿色荧光强度。

1.4.8 统计学分析 实验重复3次，所有实验数据均用统计软件SPSS 19.0进行统计分析，实验结果以均数±标准差（x±s）表示。组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Esc对SKOV3细胞活性的影响

通过CCK-8法检测卵巢癌SKOV3细胞活性如图1所示，当Esc浓度≥2μmol/L时，对细胞产生明显毒性作用，细胞活性显著降低（P<0.05）。因此，本研究选择无显著毒性Esc的3个剂量（0.2、0.4、0.8μmol/L）进行后续实验。

图1 Esc对SKOV3细胞活性的影响Figure 1 Effect of Esc on the activity of SKOV3 cells

2.2 Esc对SKOV3细胞克隆形成数的影响

通过克隆形成试验检测各组细胞增殖情况如图2所示，Control组中SKOV3细胞形成大量细胞克隆，而随Esc浓度的增加克隆形成数逐渐减少。

图2 Esc对SKOV3细胞克隆形成的影响（HE染色，200×）Figure 2 Effect of Esc on the clone formation of SKOV3 cells(HEstaining,20×)

2.3 Esc对SKOV3细胞成球数目和成球直径的影响

通过细胞成球实验检测各组细胞成球直径、成球数目结果如图3所示，与Control组比较，Esc 0.4、0.8μmol/L组和ADM 0.5μmol/L组细胞成球数和成球直径显著降低（P<0.05）。由此可见，Esc可抑制SKOV3细胞的成球能力。

图3 Esc对SKOV3细胞成球能力的影响（200×）Figure 3 Effect of Esc on spheroidizing ability of SKOV3 cells(200×)

2.4 Esc对SKOV3细胞CD44、CD133、Oct4蛋白表达水平的影响

通过Western blot检测干细胞样标记物表达情况如图4所示，与Control组比较，Esc 0.4、0.8μmol/L组和ADM 0.5μmol/L组中CD44、CD133、Oct4蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。提示，Esc可抑制SKOV3细胞干性。

图4 Esc对SKOV3细胞CD44、CD133、Oct4蛋白表达水平的影响Figure 4 Effect of Esc on the expression of CD44,CD133 and Oct4 in SKOV3 cells

2.5 Esc对SKOV3细胞线粒体膜电位的影响

通过流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化如图5所示，Control组中仅有少量细胞线粒体膜电位下降，而随Esc浓度的增加，线粒体膜电位下降的细胞数量逐渐增加。提示，Esc可降低SKOV3线粒体膜电位。

图5 Esc对SKOV3细胞线粒体膜电位的影响Figure 5 Effect of Esc on mitochondrial membrane potential of SKOV3 cells

2.6 Esc对SKOV3细胞cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9和Bcl-2/Bax比值的影响

通过Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达情况如图6所示。与对照组相比，Esc中、高剂量组和阿霉素组与Control组比较，Esc 0.4、0.8μmol/L组和ADM 0.5μmol/L组cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值显著升高（P<0.05），Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.05）。提示，Esc促进SKOV3细胞凋亡。

图6 Esc对SKOV3细胞凋亡相关蛋白表达的影响Figure 6 Effect of Esc on the expression of apoptosis-related proteinsin SKOV3 cells

3 讨论

卵巢癌（ovarian cancer）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，对女性生命造成严重威胁。放疗和化疗是卵巢癌肿瘤切除术后的标准治疗方案，但存在明显的副作用以及产生耐药性等问题［13］。中药具有生物活性广泛且低毒副作用的特点，其中Esc是中药秦皮的药用成分之一，具有抗肿瘤的重要作用。

肿瘤细胞周期失调，且分裂与增殖是持续的，不受细胞生长调控系统控制。因此本研究首先筛选出无显著毒性的Esc作用浓度，探究Esc对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。此前已有相关研究报道称，Esc可抑制非小细胞肺癌NCI-H358和NCIH1299细胞株的增殖，同时上调细胞周期抑制蛋白p27、p21表达量［10］。此外，Arora等［14］发现，Esc可抑制胰腺癌PANC-1，MIA PaCa-2和AsPC-1细胞株生长，诱导以上3种细胞周期阻滞在G1期，并上调Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达以促进细胞凋亡。王九龙等［15］发现，Esc经p70S6K/4E-BP1信号通路抑制结肠癌HCT116细胞增殖。本研究发现Esc可抑制SKOV3细胞克隆形成，提示Esc对SKOV3细胞增殖具有抑制作用。

肿瘤干细胞是肿瘤内具有胚胎干细胞类似性质的细胞，具有无限增殖、更新的能力，因此与肿瘤生长和复发存在密不可分的关联［16］。成球能力是单个癌细胞自我更新能力的重要表现，成球能力越强，细胞干性越强。CD133蛋白是卵巢癌干细胞标志物，可促使脉管系统产生，同时参与新生血管的生成，对卵巢癌细胞的生长、增殖和浸润起到促进作用［17］；CD44黏附分子与恶性肿瘤发展关系密切［18］；OCT4是多能干细胞的标记物，也是胚胎干细胞的标记［19］。本研究参照以上3种干细胞标记物表达量以评估SKOV3细胞干性。此前已有研究显示，中药组方理冲生髓饮可降低CD+44、CD+117、CD+133、CD+44、CD+117细胞数，并下调ABCC1及其mRNA表达水平，影响卵巢癌干细胞特性和顺铂敏感性［20］。本研究发现，Esc下调CD44、CD133、Oct4的表达量，抑制SKOV3细胞干性和成球能力。提示Esc抑制SKOV3细胞干样特性。

细胞凋亡是细胞维持内环境稳定的程序性死亡形式，涉及一系列基因的激活、表达以及调控。在恶性肿瘤中，细胞凋亡机制是调控肿瘤发生发展的重要机制。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）可选择性地切割某些蛋白质进而调控细胞凋亡［21］。B淋巴细胞瘤-2基因简称Bcl-2（B-cell lymphoma-2）是抗肿瘤细胞凋亡的重要基因之一，而bax基因是最主要的促凋亡基因，Bcl-2/Bax比值是决定细胞凋亡抑制作用强弱的重要指标［22］。线粒体在凋亡中起着决定性的作用，其中线粒体丧失电子转移功能并减少能量的产生，跨膜电位的消失都是细胞通过线粒体途径凋亡的标志［23］。有相关研究显示，Esc可通过上调Caspase-3、Caspase-9活性和Bax表达量，下调Bcl-2表达量，同时通过IGF-1/PI3K/Akt通路调节线粒体功能障碍诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡［24］。秦皮乙素能抑制人肺癌H460细胞的体外增殖，并能诱导H460细胞的凋亡［25］。本文与上述结果研究一致，Esc可降低SKOV3细胞线粒体膜电位，上调Caspase-3、Caspase-9活性，并降低Bcl-2/Bax比值，与已有相关研究结果相符。提示，Esc可促进SKOV3细胞凋亡。

综上所述，Esc具有抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖、细胞干性的作用，同时可促进SKOV3细胞凋亡，表现出对卵巢癌的积极治疗作用。下一步的研究将构建卵巢癌小鼠模型，探究Esc对卵巢癌组织发生发展的影响作用。