硫酸亚铁的添加量对棉籽粕中游离棉酚残留的影响

■冉 函 1， 赵海兵 1 李 进 1 张 剑 1，* 刘永茵 1 刘雨倩 1 刘玉兰

（1.武汉轻工大学，湖北省动物营养和饲料科学重点实验室，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430023）

棉籽粕(CSM)是棉籽油料加工的主要副产物之一，粗蛋白含量丰富，可以作为畜禽饲料蛋白源[1-3]。然而，由于游离棉酚的存在，其应用受限[4-5]。游离棉酚（FG），一种多酚联萘二醛的黄色化合物，广泛分布于整个棉植株的色素腺体中[6]。畜禽摄入FG后，生长和生育能力受到抑制[7-8]。在研究棉酚对虹鳟鱼毒性的试验中，含95 mg/kg FG的日粮会引起虹鳟鱼肝脏和肾脏的组织学变化；当FG增至290 mg/kg，虹鳟鱼的生长受到抑制；继续将FG含量增至531 mg/kg，虹鳟鱼的体重下降，血细胞比容、血红蛋白和血浆蛋白明显减少[9]。由于含量低至100 mg/kg FG也能引起小牛中毒，所以，棉籽粕也不能用作小牛日粮的蛋白补充剂[10]。为了预防含有棉籽蛋白的配合饲料影响动物的生长与发育，2001年我国出台了饲料的卫生标准，明确规定了配合饲料中FG含量的安全限量。例如，对于肉用仔鸡和生长鸡、产蛋鸡和生长育肥猪的饲料，每千克日粮中的FG含量相应不超过100、20 mg和60 mg[11]，其中，肉用仔鸡和生长鸡相同，均为100 mg，产蛋鸡为20 mg，生长育肥猪为60 mg。

为了降低饲料的生产成本，进一步提高棉籽蛋白在饲料中的比例，在使用棉粕前，有必要采取某些措施以降低棉籽蛋白中游离棉酚（FG）含量。围绕这一话题，科技工作者一直在寻找降低物料中游离棉酚残留的方法。如：溶剂萃取法[12-13]、固态发酵法[14-15]、硫酸亚铁法[16]等。在这些方法中，硫酸亚铁价格低廉、来源广泛，且能快速降低FG的含量而备受关注。2019年，棉籽粕脱毒深加工与利用课题组确认了5种棉酚铁复合物的结构。其中，棉酚与Fe2+按1∶2摩尔比配位形成的化合物有2个，另外3种棉酚铁化合物分别以1∶1，1∶3，1∶4摩尔比形成[17]。研究圆满地解释了非水溶剂中亚铁离子与FG形成的复合物的结构，但是，对于水溶液中棉酚铁复合物的稳定性报道很少，而且，迄今为止国内外尚未建立亚铁离子的添加量与棉籽粕中游离棉酚残留的关系。因此，研究棉籽粕中游离棉酚的残留与亚铁离子添加量的关系，不仅关系到被饲养动物的生长性能，而且还能对棉籽蛋白的合理利用提供理论指导。文章研究了硫酸亚铁水溶液对棉籽粕中游离棉酚残留的影响，同时，还探讨了水溶液中棉酚铁复合物的稳定性，分析了结合棉酚转化为游离棉酚的条件。该研究成果对棉籽粕的合理利用具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

棉籽粕（网络购得，经研磨机粉碎后收集，过60目筛的物料筛，混匀，备用。经间苯三酚法分析后，该棉籽粕中的FG含量为1 156 mg/kg）；醋酸棉酚(GAA)为Sigma试剂；其他试剂（苯胺、间苯三酚二水合物等）均为国产分析纯。7200型分光光度计（UNIC公司），pHS-3C型数字pH仪（上海INESA科学仪器有限公司），数显水浴锅（国华电器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 含硫酸亚铁的缓冲液制备

准确称取一定量的七水硫酸亚铁固体，溶于相应的缓冲溶液中，通过逐滴滴加盐酸或氢氧化钠将溶液酸度调至给定的pH值，定容。pH值为0.3、0.5、1.0和1.5的硫酸亚铁溶液用0.2 mol/L的三氯乙酸-三氯乙酸钠缓冲液配制；pH值为2.0，2.5，3.0，3.5的硫酸亚铁溶液以0.2 mol/L的氯乙酸-氯乙酸钠缓冲液配制；pH值为4.0、4.5、5.0、5.5的硫酸亚铁用0.2 mol/L的HAC-NaAC缓冲液配制。

在试验中，准确称取棉籽粕500.0 mg(精确至0.1 mg)，加入2.0 mL含硫酸亚铁的缓冲液，混匀。于一定温度条件下水浴反应一段时间后，测定棉籽粕中游离棉酚的残留。对于亚铁离子添加量与棉籽粕中游离棉酚的摩尔比对游离棉酚残留的影响试验，反应酸度控制在pH 3.5，反应温度和时间分别为25℃、2 h。在酸度、温度和反应时间的试验中，通过控制其他变量不变，改变一个单因素开展试验。

1.2.2 棉籽粕中游离棉酚含量的测定

苯胺法是国内外官方规定测定含棉籽粕干燥样品中游离棉酚含量的方法。该法对游离棉酚定量的原理如下：游离棉酚与苯胺定量反应生成一种二苯胺棉酚的衍生物。该化合物的显色反应需在沸水浴中热处理30 min[18]。然而，经过我们深入细致的研究后发现，该方法并不适用于硫酸亚铁处理过的棉籽粕中的FG准确定量。因为沸水浴的热处理，会将亚铁离子快速氧化为红色化合物，进而干扰二苯胺棉酚衍生物的比色测定。此外，在强酸性环境下苯胺与氢离子结合成苯胺盐，使二苯胺棉酚衍生物的形成受到抑制。因此，苯胺法也不适用于强酸性环境下对棉籽粕中的游离棉酚准确定量。

干燥棉籽粕中的FG定量也常采用间苯三酚法[19]。其原理为：在高酸性的HCl介质中，FG与间苯三酚试剂定量反应，生成的有色物质在550 nm处有最大吸收，颜色深浅与FG含量呈正比，据此定量[20]。研究表明，该法反应条件温和，分析样品勿需高温热处理，能满足对硫酸亚铁处理过的棉籽粕中游离棉酚的定量要求。

准确称取棉籽粕500 mg（精确至0.1 mg），加入2.0 mL含硫酸亚铁的缓冲液，混匀。于一定温度（如：25、30、35、40、45、50、55、60℃）水浴反应0.5～3 h，测定棉籽粕中F G残留。在研究亚铁离子添加量与棉籽粕中游离棉酚的摩尔比对游离棉酚残留的影响试验中，将酸度、温度和反应时间分别控制在pH值3.5、25℃和2 h；在酸度试验中，反应温度和时间分别为25℃、2 h；在温度试验中，酸度和时间分别控制在pH值3.5、2 h；在考虑时间的影响试验中，分别将酸度和温度控制在pH值3.5、25℃。

2 结果与讨论

2.1 亚铁离子与棉籽粕内游离棉酚的摩尔比

亚铁离子添加量与棉籽粕中游离棉酚的摩尔比，是影响棉籽粕中游离棉酚残留量的最重要因素之一。保持其他反应条件（反应酸度、温度和时间分别为pH 3.5、25℃、2 h）不变，试验了亚铁离子的添加量对棉籽粕中游离棉酚残留的影响（见图1）。游离棉酚的残留量随硫酸亚铁浓度的增加而逐渐减少，这是由于硫酸亚铁与棉酚反应形成不溶于水的棉酚铁复合物的缘故。当亚铁离子与游离棉酚的摩尔比为5∶1时，棉籽粕中游离棉酚的残留为854 mg/kg。进一步地将摩尔比提高至10、20、40、50、70、80倍，棉籽粕中的游离棉酚残留量相应从1 156 mg/kg降至629、440、333、222、146 mg/kg和66 mg/kg。考虑到棉籽粕中的其他有机成分(如植酸、单宁、蛋白质等)也能与亚铁离子结合，硫酸亚铁的实际添加量要远高于理论值。动物试验表明，用硫酸亚铁晶体处理棉籽粕，按4∶1的亚铁离子对游离棉酚的重量比加料，能抑制蛋黄变色[21]。该剂量相当于亚铁离子对游离棉酚的摩尔比为37∶1加料，所对应的棉籽粕中游离棉酚含量为400 mg/kg以下。因此，在生产含棉籽蛋白的合成饲料时，既要考虑被饲养的动物对游离棉酚忍受性的差异，也要兼顾饲料的适口性，以及被饲养动物的生长性能等因素，将硫酸亚铁的添加量控制在一个合理范围。

图1 Fe2+与FG摩尔比对FG残留的影响

2.2 酸度

酸度是影响棉籽粕中游离棉酚残留的最主要因素。酸度直接关系到结合棉酚的稳定性以及棉酚铁复合物的形成。酸度对棉籽粕中游离棉酚残留的影响见图2。当pH≤2.0时，棉籽粕或者经亚铁盐处理过的棉籽粕中游离棉酚的残留量随反应初始酸度的增加而迅速增加，这是由于部分结合棉酚转化为游离棉酚的缘故，该结果与之前的报道一致[22]。在酸性条件下棉酚-蛋白可降解为游离棉酚和蛋白。由此可以预见，当含有棉籽粕的饲料通过单胃动物的胃时，极少量的结合棉酚在胃酸（pH值1.8）的作用下转化为游离棉酚，进而使生物体内的游离棉酚含量略有提高。此外，由于亚铁离子与游离棉酚结合要释放出氢离子，导致棉酚铁复合物的形成受到抑制。这与Zhang等[17]研究的棉酚铁复合物的形成需要释放氢离子的结果相符。因此，高酸性环境对降低棉籽粕中的游离棉酚残留不利。当pH≥2.0时，未经亚铁盐处理的棉籽粕，其游离棉酚残留受酸度的变化影响小，这表明：在pH值≥2.0时结合棉酚的稳定性好，难以分解成游离棉酚。然而，酸度的变化对经硫酸亚铁处理后的物料中的游离棉酚残留影响较大。在2≤pH值≤3.5的范围内，棉籽粕中的游离棉酚呈下降趋势，且在pH值3.5时降至最低，这是由于该酸性环境是硫酸亚铁在水溶液中存在的最稳定形式。当物料的pH值=4.0时，游离棉酚残留量较pH值3.5时有所反弹。此后，随着物料酸度降低，棉籽粕中的游离棉酚残留逐渐下降。这是由于低酸度环境能促进游离棉酚分子中的酚羟基解离，利于棉酚铁复合物形成。总体来讲，在给定的酸度下，经硫酸亚铁处理过的棉籽粕物料中的游离棉酚残留要比对照低，而且，随着亚铁盐补充量增大，游离棉酚的残留也越低。

图2 酸度对FG残留的影响

2.3 反应时间

反应时间是降低棉籽粕中游离棉酚残留的另一关键因素。反应时间对游离棉酚残留的影响见图3。当反应时间介于0.5～2.0 h时，游离棉酚的残留量随时间的延长而减少，在2 h时降至最低。继续延长反应时间，对棉籽粕中游离棉酚残留的降低贡献不大。可见，较短的作用时间，导致亚铁离子和游离棉酚之间的化学反应不充分，出现高残留的游离棉酚现象。2 h后，棉酚铁复合物的形成达到平衡状态。因此，反应时间设定为2 h较为合理。

图3 时间对棉籽粕中FG残留的影响

2.4 反应温度

温度是影响化学反应速率的一个重要因素。温度对物料中的游离棉酚残留的影响见图4。由图4不难得出，低温利于减少棉籽粕中游离棉酚的残留量，这说明棉酚铁复合物的形成是一个放热过程。在实际脱毒过程中，一般选用常温条件下操作，即将一定量的七水硫酸亚铁晶体添加至棉粕中，充分混匀。在饲养动物前1～2 h，补加适当的水，调和完毕后，再供动物饲用。

图4 温度对棉籽粕中FG残留的影响

3 结论

向棉籽粕中补充硫酸亚铁，利于减少游离棉酚的残留。棉酚铁复合物的形成为放热过程，2 h的反应能形成稳定的棉酚铁复合物。另外，高酸性环境能抑制棉酚铁复合物的形成，同时还会导致部分结合棉酚转化为游离棉酚。