Eph/Ephrin信号通路在原发性骨肿瘤及骨癌疼痛中的作用研究进展

陈祥义, 于得臣, 张芮浩, 胡一村, 王克平, 2, 周海宇, 2

(1.兰州大学第二医院 骨科, 甘肃 兰州, 730030; 2.兰州大学第二医院西固医院 骨科, 甘肃 兰州, 730030)

促红细胞生成素肝细胞激酶(Eph)受体及其配体(Ephrin)属于最大的受体酪氨酸激酶(RTKs)家族，其在生物体内的功能十分复杂。Eph因在人肝细胞癌细胞系中表达产生促红细胞生成素而命名，是受体酪氨酸激酶的一个亚家族，在许多类型的细胞信号传递中起着重要作用。1987年, Hirai首次发现并证明Eph基因表达的产物是一种跨膜蛋白，当时认为其是生长因子的受体，并推测其在肿瘤致病过程中发挥作用。经过不断的深入研究, Eph/Ephrin参与癌症发生和发展的作用得到证实[1]。此外, Eph/Ephrin还通过双向信号参与细胞骨架形成、细胞黏附、细胞间连接、细胞形态和运动，影响神经元的发育和骨骼稳态等，是血管生成和淋巴管生成的关键因素。Eph/Ephrin在成骨、破骨细胞信号传导和维持骨平衡、骨折愈合等方面也发挥作用，如EphB4/EphrinB2反向信号抑制破骨细胞分化，正向信号增强成骨细胞分化，通过该双向信号传导参与骨稳态平衡和骨重建[2]。本研究主要讨论了Eph/Ephrin在原发性骨肿瘤及转移性骨肿瘤导致的骨癌疼痛(BCP)中的作用机制，为骨肿瘤和BCP临床靶向药物的研究提供新思路。

1 Eph/Ephrin家族组成及结构

Eph和Ephrin依据结构不同都可以分为A、B两个家族, Eph包括EphA(EphA1-8, EphA10)、EphB(EphB1-5), Ephrin包括EphrinA(EphrinA1-5)、EphrinB(EphrinB1-5)。Eph与其他大多数类型的RTKs一样属于跨膜蛋白，其中胞外区属于配体结合区，其包含配体结合域、富含半胱氨酸的区域和2个富含纤维蛋白Ⅲ的区域; 胞内区是功能区，包括近膜区(含2个酪氨酸残基)、经典蛋白酪氨酸激酶结构域、不育α基序(SAM)和包含疏水残基的突触后致密蛋白(PDZ)结构域。Ephrin的2种类型结构不一样, EphrinA通过糖脂磷脂酰肌醇(GPI)连接到细胞表面, EphrinB通过跨膜结构域连接到细胞表面，EphrinB的胞内功能区有高度保守的区域和PDZ结构域[3]。这些结构序列控制和调节不同受体和配体之间的结合，以引起不同的生理和病理反应。Eph/Ephrin的结构见图1。

图1 Eph/Ephrin结构图

Eph/Ephrin信号传导模式多样。Ephrin能与细胞膜上的非Eph受体结合，例如Ephrin-B2介导血管内皮生长因子受体和血小板衍生生长因子受体家族成员的内吞作用，从而参与肿瘤血管的生成和伤口修复[4-5]。Eph和Ephrin可进行双向信号传导。Eph与聚集的、膜附着的Ephrin结合时被激活，然后通过与衔接蛋白偶联将信号传导到细胞内，通过自身磷酸化和酪氨酸残基的磷酸化实现整个信号传导[6]。Eph通过 SAM和C-末端PDZ结构域与其他蛋白结合传导信号。EphrinA通过GPI与跨膜部分相互作用，而EphrinB的信号传导分为磷酸化依赖性和非磷酸化依赖性。EphrinB的胞内结构域的酪氨酸磷酸化导致信号分子募集从而传导信号，而未磷酸化的EphrinB与信号蛋白结合传导信号，且受酪氨酸磷酸化状态调节[7]。邻近细胞之间的Eph和Ephrin结合产生细胞依赖的双向信号，能调节细胞的形态、运动、存活和增殖[8-9]。EphA和EphB受体之间也能结合并交叉磷酸化调节细胞功能[10]。Eph受体激活的程度及信号类型取决于配体的聚集状态。Eph与Ephrin相互作用形成Eph/Ephrin四聚体，促进高阶低聚物的组装，这是Eph磷酸化和下游信号激活的前提[11]。研究[12]表明，Eph信号能参与包括黑色素瘤、神经母细胞瘤、恶性神经胶质瘤、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、卵巢癌、食管癌、肝癌在内的多种肿瘤的发生、发展。Eph/Ephrin信号转导能通过激活Src、STAT3、MMP8和RAC1等促进多种肿瘤细胞的上皮间质转化和侵袭[13]。

2 原发性骨肿瘤与Eph/Ephrin

2.1 骨髓瘤与Eph/Ephrin

骨髓瘤起源于骨髓造血组织，是因浆细胞过度增生引起的恶性肿瘤。骨髓瘤易产生多发性骨损害，又称多发性骨髓瘤(MM)，约占血液恶性肿瘤的10%[14]。在MM患者中，约80%的患者存在骨痛、病理性骨折、椎体塌陷和高钙血症，此类患者预后较差[15]。EphrinB2/EphB4信号在成骨和破骨细胞信号传递和功能维持中发挥重要作用[16]。PENNISI A等[17]发现MM患者骨髓间充质干细胞中EphrinB2/EphB4表达降低。在MM患者的间充质干细胞中, Wnt3a促进靶基因EphB4的表达。EphrinB2-Fc促使EphB4磷酸化，从而抑制MM患者间充质干细胞的成骨作用。OSHIMA T等[18]证明骨髓瘤细胞产生Wnt通路抑制剂Frizzled相关蛋白2, 从而抑制MM患者成骨细胞的生成和骨形成。因此，骨髓瘤患者中EphB4的下调可能是因为骨髓瘤Wnt信号通路被抑制所致。PENNISI A等[17]还发现MM患者的成骨能力受到了损害。

EphB4-Fc治疗能抑制骨髓瘤生长、破骨细胞形成和血管生成，并刺激成骨细胞生成和骨形成，而EphrinB2-Fc能刺激血管生成、成骨细胞生成和骨形成，但对破骨细胞生成和骨髓瘤生长无影响。上调骨细胞内源性EphB4和EphrinB2的表达(例如用Wnt3a治疗)或者外源性增加EphB4水平(例如用EphB4-Fc处理)可能有助于恢复骨重塑能力，同时抑制多发性骨髓瘤的生长、骨病发生和血管生成。GUAN M等[19]发现EphA3在MM中高表达。研究[20]显示EphA3缺失能抑制MM患者血管内皮细胞(MMECs)体外血管生成，但是缺失EphA3并不影响正常内皮细胞(ECs)的血管生成功能，而且在体外抗EphA3抗体能降低MMECs的血管生成。EphA3还影响MMECs细胞的黏附，但是对凋亡几乎无影响[21]。EphA4能通过调节细胞周期和增加Akt的磷酸化(p-AKT)促进MM细胞的增值而抑制其凋亡，还能通过MM细胞中p-AKT促进细胞黏附、介导其耐药。虽然目前其参与耐药的具体机制还没有研究清楚，但这可能是MM患者耐药的一个分子靶点。

2.2 尤文氏肉瘤、软骨肉瘤与Eph/Ephrin

尤文氏肉瘤(ES)是一种罕见的、高度侵袭性的肿瘤，多见于长骨骨干、骨盆，占儿童肿瘤的3%，是儿童和青少年时期较为常见的骨肿瘤，肿瘤局限患者生存率为70%～80%, 肿瘤患者生存率约为30%[22]。ES虽对放疗敏感，但易发生转移，单纯的放疗难以对转移和复发病例产生效果。虽然目前采用的综合治疗方案使ES患者的生存率有所提高，但是肿瘤转移患者的整体预后较差。血道转移是经典的肿瘤转移方式, EphA2在肿瘤血管生成中的作用已被证实[23]。SAINZ-JASPEADO M等[24]探讨了EphA2在ES血管生成中的作用及其与小窝蛋白1(CAV1)的关系，结果显示EphA2是ES血管生成的条件, EphA2-CAV1轴能促进血管内皮细胞向肿瘤迁移，从而有利于ES的血管生成。若能特异性阻断这种作用，将会延缓肿瘤进展，降低肿瘤转移风险，为临床治疗提供一定的帮助。

软骨肉瘤是一种成软骨性的恶行肿瘤，约占骨原发性恶性肿瘤的20%, 通常发生在骨盆或长骨中，常出现黏液样变、钙化和骨化。软骨肉瘤可以单发，也可以由内生软骨瘤和骨软骨瘤恶变而来[25]。KALINSKI T等[26]发现软骨肉瘤中EphrinA5下调，且与软骨肉瘤的恶性程度呈负相关。因此，EphrinA5在软骨肉瘤中可能发挥抑癌基因功能, EphrinA5与细胞的黏附有关[27], 推测EphrinA5的下调导致肿瘤细胞迁移和侵袭能力上调是通过细胞的黏附功能实现的，当然这需要进一步探索。

2.3 骨肉瘤与Eph/Ephrin

骨肉瘤是好发于青少年的一种高度侵袭性骨肿瘤，目前的综合治疗的疗效有所提高，但5年生存率依然很低。ABDOU A G等[28]发现EphrinA4在骨肉瘤细胞中有2种不同的表达模式，即胞质模式和核质模式。EphrinA4在骨肉瘤患者中表达强于正常和原发性骨肉瘤患者。核质模式在正常骨中占优势，在恶性病例中减少，而在侵袭性转移的恶性病例中，其染色模式都呈现为细胞质模式[28]。胞质模式与肿瘤类型、分期和转移存在明显相关性，即病理类型分化越差、分期越晚，发生转移的病例中胞质模式占比更高。EphrinA4在胞质的表达与原发性骨肉瘤的进展和不良预后相关, 95%的胞质模式患者对化疗反应较差，证明EphrinA4胞质染色模式可能是骨肉瘤具有高侵袭性、预后不良的指标[29]。EphrinA4有2种染色模式，可能因位置不同而发挥不同的功能，在胞质中可增强肿瘤细胞侵袭性，核质型向胞质型的转化可能是肿瘤进展的一种机制，但具体通过何种途径向胞质型转化尚未阐明。换言之，靶向阻断其向胞质型模式转化，可能会减缓肿瘤进展、降低OS患者化疗耐药。

与健康骨组织相比, EphA2在人类OS肿瘤样本中上调，且与患者存活率低有相关性。研究[30]表明，靶向腺病毒载体可以通过EphA2内化到OS细胞中，与人类初级成骨细胞相比, OS细胞的这种摄取率更高。通过EphA2靶向递送药物可能是提高OS疗效的策略。研究[31]显示EphrinA1配体结合EphA2受体可促进Ras-MAPK信号通路的激活，而且EphrinA1-EphA2信号增强了骨肉瘤细胞的迁移。虽然机制尚不清楚，但是EphrinA1-EphA2既参与上调Ras-MAPK信号通路的激活，又促进骨肉瘤细胞的迁移，相信EphrinA1-EphA2将来可能会成为OS治疗的一个靶点。Notch信号具有促进骨肉瘤增殖、增强化学耐药性、促进迁移和侵袭、促进原发性肿瘤生长和肺转移等作用。研究[32]显示EhrinB1是Notch途径的作用靶点，激活的Notch信号诱导EphrinB1的表达，上调EphrinB1信号可促进肿瘤进展，而且EphrinB1缺失能减轻Notch信号介导的骨肉瘤化疗耐药性。Notch信号介导多种肿瘤的进展，目前的研究已经证明其在OS中是通过EphrinB1发挥重要作用的，进一步深入研究其中的具体机制将具有广阔前景。

3 转移性骨肿瘤所致的BCP与Eph/Ephrin

恶性肿瘤经常发生转移，而骨是肿瘤最常见的转移器官之一，可以使骨发生成骨或溶骨性改变。研究[33]统计60%～84%的晚期癌症患者会经历不同程度的骨痛，当肿瘤转移时，患者的生存周期将大幅下降，而且常会发生严重并发症，如病理性骨折、癌症性骨痛、神经压迫等。目前BCP尚无有效的治疗方法，主要还是使用阿片类镇痛剂，因此急需寻找一种能减轻BCP的方式。在乳腺癌骨转移模型中，脊髓中EphrinB1和EphB1表达显著增加。小鼠脊髓鞘内注射EphB1阻断剂EphB1-Fc可显著减轻骨癌引起的机械性疼痛，而且骨转移模型小鼠相对于正常小鼠的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达上调，而鞘内注射EphB1-Fc后其含量显著降低[34]。所以, EphB1-Fc鞘内注射可能是一种有效减少BCP发生的方式。YU S N等[35]采用BCP小鼠模型发现miR-129-5p通过抑制EphB1/EphrinB2信号表达发挥镇痛作用，这可能会是一个有效的治疗靶点。

LIU S等[36]发现BCP与脊髓背角和初级神经元中EphB1及EphrinB2的上调相关。特异性阻断EphB1减少了BCP中NR1和NR2B受体、Src的磷酸化，以及随后各种依赖Ca2+的信号酶、CREB、c-Fos的激活和骨癌疼痛行为的激活。阻断EphB1后还能解除BCP对吗啡治疗的耐受，故脊髓中EphB1受体信号对骨癌疼痛的发展和解除癌性疼痛的吗啡耐受至关重要。鞘内注射EphB1受体阻断剂EphB2-Fc后，病理学观察发现肿瘤相关性骨破坏有所改善。此外, EphB1受体还通过Toll样受体激活脊髓中神经胶质细胞和小胶质细胞的IL-1β和 TNF-α参与BCP[37]。因此, EphB1参与BCP的发生、发展，而且与吗啡耐受有关，并能改善BCP患者骨破坏, Eph/Ephrin在骨肿瘤及BCP中的作用见表1。

表1 Eph/Ephrin在骨肿瘤中的作用

4 小 结

Eph/Ephrin已经成为多种癌症的调节因子，能够增强或者抑制致癌信号的活性。但是，目前对Eph/Ephrin如何在分子水平上调节肿瘤的发展知之甚少。Eph/Ephrin参与肿瘤血管生成、化疗耐药和BCP的发生过程，可能会成为肿瘤分级及预后标志物，并有望改善肿瘤相关的骨破坏。特异性的靶向药物是目前研究的热点，目前在Eph/Ephrin中也有相关研究[38], 例如抗EphrinA4-卡奇霉素结合物能有效靶向作用于三阴性乳腺癌和卵巢肿瘤起始细胞，导致肿瘤持续消退。总之，在原发性或者转移性骨肿瘤中Eph/Ephrin发挥了明显的作用，充分理解其内在的分子作用机制，将有助于阐明骨肿瘤发生和转移的机制，并有助于开发新的抗癌疗法。