丹参素与小鼠心脏中的内质网Ca2+渗漏通道SEC61α相互调节心肌梗死后纤维化的作用

刘俊雄 王毅

心肌梗死是目前较为常见且预后较差、病情危险的一种疾病[1]。若治疗不及时，很容易造成严重后果，且每年因此造成的死亡或残疾人数，不仅给家庭和社会造成巨大负担，也严重影响着患者的身心健康和生活质量[2]。心肌梗死后的心肌纤维化属于机体心力衰竭、心脏肥大的一种病理学特征，主要表现为机体心脏大量胶原蛋白、细胞质基质的沉积及纤维细胞的大量增殖[3]。目前，临床上对于心肌梗死治疗的效果较为显著，在一定程度上降低了患者的病死率，但未达到抑制其心肌纤维发展的目的，最终导致机体因心肌衰竭而出现心律失常、猝死等并发症。同时，心肌梗死产生的心肌纤维化属于较为持久，且难以逆转的病理现象，因此引发的心机重构是机体内多种慢性疾病发生的重要病理学特征，可通过影响器官正常的生理结构，造成器官正常功能异常，严重时可致使疾病恶化现象加剧[4]。本文主要通过研究丹参素对心肌梗死小鼠心肌纤维化的影响和作用机制，进而增加心肌梗死纤维化的有效治疗的可能性，为临床提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级C57BL/6小鼠[合格证号：SCXK(粤)2016-0041]，雄性，体重(20±2)g，购自武汉大学下属机构实验动物中心。每天定点给予12 h光照时间，饲养环境温度在(22±3)℃，湿度为55%左右，所有小鼠在实验期间可自由饮食。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:随机将72只C57BL/6小鼠分成4组，每组18只，分别为假手术组、模型组、卡托普利组和丹参素组。

1.2.2 小鼠心肌梗死模型的建立:取模型组和药物处理组小鼠，使用40 mg/kg剂量的戊巴比妥钠经腹腔注射将其麻醉后，通过气管插管后给予呼吸器，并使用室内空气进行辅助通气，其中通气参数设置为：呼吸频率68 cylces/min，潮气量8 ml/100 g。使用75%乙醇消毒后，从小鼠第四肋骨位置处进行胸廓切手术。利用锥形针，将1-0的丝线通过小鼠左冠状动脉开端穿入，使用丝线扎紧形成冠状动脉闭塞。假手术组处理方式与上述方式相同，但不结扎。

1.2.3 实验方法:造模成功后，假手术组和模型组给予160 mg·kg-1·d-1的0.9%氯化钠溶液作为实验对照，卡托普利组和丹参素组给予等量的丹参素进行灌胃，给药时间为7周。

1.2.4 小鼠心脏超声评价:灌胃第7周后，使用40 mg/kg剂量的戊巴比妥钠经腹腔注射将其麻醉后，使用超声系统测量小鼠左心室的收缩末期内径(LVESd)、射血分数(LVEF)和舒张期末期内径(LVEDd)及缩短分数(LVFS)。

1.2.5 心重指数测定:末次给药后，进行小鼠全身称重并记录；随后取小鼠心脏，在相对稳定的空间内称重并记录，根据全心重/体重值得到心重指数(CWI)(mg/g)。

1.2.6 羟脯氨酸含量测定:取小鼠心脏，利用羟脯氨酸含量测定试剂盒检测小鼠心脏内羟脯氨酸含量。

1.2.7 SOD与MDA水平检测:取小鼠心肌组织，加入0.9%氯化钠溶液于低温条件下制成5%匀浆，并以3 000 r/min离心5 min，取上清液保存待用。按照SOD活力测定试剂盒和硫代巴比妥酸法检测小鼠心肌组织SOD和MDA含量。

1.2.8 组织切片染色:小鼠心脏超声检测后，将心脏标本按照Masson染色试剂盒说明书进行染色处理。

1.2.9 Western blot检测:取小鼠左心室的心肌组织，使用组织蛋白裂解液将其裂解后获得总蛋白，并使用BSA测定蛋白浓度。取35 μg的总蛋白通过SDS-Page电泳实验后，根据湿转法进行转膜实验，随后按照SEC61一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜，显影的方法，最后将其置于化学发光成像仪上进行呈像。结果利用Image J进行分析。

2 结果

2.1 丹参素对小鼠心功能指标的影响 模型组小鼠LVESd、LVEDd水平均高于假手术组，其LVEF和LVFS水平均低于假手术组(P<0.05)。同时丹参素组小鼠LVESd、LVEDd水平低于模型组，LVEF和LVFS水平均高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 心脏超声检测4组小鼠的心脏指标

2.2 丹参素对小鼠心重指数的影响 模型组CWI高于假手术组、卡托普利组和丹参素组小鼠(P均<0.05)，说明丹参素可降低心肌梗死小鼠CWI。见表2。

表2 小鼠心重指数变化

2.3 丹参素对小鼠心脏羟脯氨酸含量的影响 模型组小鼠心肌组织内羟脯氨酸含量高于假手术组和药物处理组(P均<0.05)，由此可知，丹参素可降低心肌梗死小鼠心肌羟脯氨酸含量水平。见表3。

表3 小鼠心脏羟脯氨酸含量变化

2.4 丹参素对小鼠心脏氧化应激水平的影响 心肌梗死模型组小鼠的SOD水平低于假手术组和药物处理组(P<0.05)，而MDA水平均高于假手术组和药物处理组(P<0.05)，根据SOD和MDA测定结果可知，丹参素可降低心肌梗死小鼠的SOD水平，升高小鼠MDA水平。见表4。

表4 SOD和MDA水平测定

2.5 丹参素对小鼠胶原容积分数的影响 模型组小鼠的胶原容积分数高于假手术组和药物处理组(P均<0.05)，可知丹参素可降低心肌梗死小鼠胶原容积分数。见表5。

表5 小鼠心肌组织胶原容积分数比较

2.6 丹参素对小鼠心脏SEC61α蛋白表达的影响 心肌梗死模型组小鼠SEC61α蛋白相对表达水平高于假手术组和药物处理组(P均<0.05)，可知丹参素可降低心肌梗死小鼠SEC61α蛋白的相对表达水平。见表6，图1。

表6 SEC61α蛋白相对表达结果

图1 Western blot结果；1、2、3、4分别代表假手术组、模型组、卡托普利组和丹参素组小鼠 SEC61α蛋白表达结果

3 讨论

内质网属于真核细胞中用于蛋白合成的一种重要细胞器[5]。当机体出现氧化应激、缺氧、异常糖基化、Ca2+失衡等情况下，机体内存在的未折叠蛋白质增多，造成内质网处理能力失衡，最终导致内质网应激[6]。SEC61属于内质网膜上可用于双向性转运蛋白的异源性复合物[7]。在真核细胞中，SEC61主要由SEC61α、SEC61β和SEC61γ组成的3聚复合物，主要作用是在集体内部形成疏水通道，促进由核糖体合成的多肽由此穿过内质网内部[8]。SEC61α通道蛋白在结构上具有10次可用于跨膜的结构域。研究发现，SEC61α突变可破坏内质网蛋白双向转运，诱导机体内质网应激反应的产生[9]。心肌纤维化是心力衰竭和心脏肥大的重要特征，目前，对于心肌梗死理想的治疗方式就是抑制机体纤维化水平，促进机体心肌再生。因此，对于控制心肌梗死后机体心肌纤维化水平对于改善心脏功能和心脏重构等具有重要意义。

本研究发现，丹参素可降低心肌梗死小鼠心肌组织LVESd、LVEDd，同时降低心肌梗死小鼠CWI、心肌羟脯氨酸含量、SOD、胶原容积分数和SEC61α蛋白相对表达水平，升高小鼠LVEF、LVFS、MDA水平。

丹参属于唇形科中的一种鼠尾草属植物，具有抑制血小板聚集、扩血管、强心、抗炎症等功效[10]。目前，由丹参制成的丹参注射液已被广泛用于妇科疾病和心血管疾病的治疗中，同时研究发现，丹参素可通过对心脏的保护作用和其抗氧化作用达到抑制机体内出现的心脏肥大[11]。丹参素的抗氧化和心脏保护作用可用于抑制机体心脏肥大[12]。研究发现，丹参素能通过TGF-β1/Smad3通路，达到抑制机体肾纤维化的结果，在其肝纤维化的治疗中亦具有显著的防治效果[13]。在对压力复合小鼠的研究中发现，压力负荷小鼠具有显著的氧化应激反应，在此过程中机体产生较多的超氧化物，刺激机体信号通路的产生，进而导致心肌成纤维细胞的大量增殖，而丹参素可显著降低氧化应激反应，减少机体胶原蛋白的合成，的同时降低纤维化水平，达到改善小鼠心功能的作用[14]。在利用异丙肾上腺素建立的小鼠纤维化的模型中，发现其CVF、CWI及Hydro均显著增加，而采用降纤维化药物作用后，以上指标均显著下调[15]。研究证实机体氧自由基的大量产生和脂质过氧化但应的发生是导致心肌纤维化水平发展的重要因素[16]。SOD时氧自由基消长情况的直接反映指标，当机体出现纤维化时，SOD活性会明显降低，从而促使氧自由基的堆积，导致其转化成羟自由基后可致使心肌细胞膜出现脂质过氧化作用，最终导致心肌损伤[17]。而MDA作为脂质过氧化物，在一定情况下可用于间接反映机体的氧自由基的产生情况[18]。在对葛根素对心肌梗死小鼠作用的研究中发现，葛根素可通过增强小鼠心肌组织SOD活性，降低MDA水平，达到抑制机体纤维化的作用[19]。

综上所述，丹参素可通过抗氧化、心脏保护及与降低SEC61α蛋白表达等功效，达到改善心肌梗死后出现的心肌纤维化的目的。