鞣花酸缓解阿霉素诱导的大鼠局灶节段性肾小球硬化

周翔 成平 陆衡程 贺理宇

局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是临床上常见的一种肾脏疾病的病理形态学诊断定义，以部分肾小球及(或)其毛细血管袢发生局灶化病变为主要病理表现[1，2]。蛋白尿、血尿是其主要的临床表现，各种治疗方案的效果不一，导致病情呈慢性进行性发展，最终可进展成终末期肾病(ESRD)。FSGS可见于任何年龄，但儿童及青少年更加多见，而且近年来其发生率有增高趋势[3，4]。既往研究显示，遗传背景、氧化应激、炎性反应、免疫紊乱等都与其发病有关，但发病机制尚不完全明确[1,2,4,5]。所以探索和阐明其发病机制，找到其新的治疗靶点，对全球卫生健康和经济负担都有重大意义[6]。哺乳动物不育系20样激酶(MST1)是Hippo通路中的核心成员之一，在调节巨噬细胞中活性氧的产生和细菌杀伤中起到重要的作用，核因子E2相关因子2(Nrf2)通过促进下游抗氧化基因及解毒酶基因表达,发挥抗氧化作用。Mst1-Nrf2通路参与细胞氧化应激和炎性反应等多种生物学反应。Nrf2基因激活后能够抑制线粒体活性氧(ROS)和炎性因子的产生，Mst1缺乏可以减轻细胞氧化应激，但Mst-Nrf2通路在FSGS作用尚不十分明确[7-11]。鞣花酸(ellagic acid，EA)是一种广泛存在于多种软果、坚果类植物中的一种天然多酚，国内外既往研究证明，EA具有清除自由基、抑制脂质过氧化等抗氧化、抗炎及激活自噬抑制癌细胞增殖等生物活性功能[11-14]。但EA作用的确切的分子机制尚不明确，EA是否可能通过Mst-Nrf2通路参与氧化应激和炎性反应而发挥肾脏保护作用尚未有研究证实。故本实验通过构建阿霉素诱导的经典FSGS 大鼠模型，进而研究EA在阿霉素诱导的FSGS大鼠中是否存在调节氧化应激的肾脏保护作用及分析可能的分子机制，以期在临床治疗FSGS时提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 购自长沙斯莱克景达实验动物有限公司的SD雄性大鼠30只[合格证号：SCXK(湘)2019-0004]，200～250 g，动物房常规环境，标准饲料饲养，自由摄食及饮水。试剂：鞣花酸购买自美国Sigma 公司，阿霉素针剂购自于美国辉瑞制药有限公司。

1.2 模型建立及实验分组 将健康SD大鼠30只随机编为对照组(6只)、模型组(12只)、实验组(12只)3组。对照组大鼠尾静脉一次按10 ml/kg注射0.9%氯化钠溶液，模型组和实验组大鼠尾静脉一次按10 mg/kg剂量注射阿霉素(阿霉素1 mg/ml溶于0.9%氯化钠溶液)，实验组再每日按200 mg/kg 的剂量注射鞣花酸，模型组每日注射同等量0.9%氯化钠溶液，注射时间均持续6 周[15-17]。6周后处死所有组别大鼠，并收集肾脏、血液、尿液标本并按实验常规要求保存。3组大鼠血尿标本复融离心后采用全自动生化仪检测并分析血肌酐、尿素氮、血浆白蛋白、可溶性尿激酶、24 h尿总蛋白及血胆固醇的结果。将各组大鼠肾组织取出匀浆离心取上清液后，采用硫代巴比妥酸法检测各组大鼠肾组织丙二醛的含量，采用Sedlak和Lindsay的方法测定肾组织中还原型谷胱甘肽的含量，采用Lawrence和Burk的方法测定GSH过氧化物酶活性、采用Aebi的方法测定肾组织过氧化氢酶活性。

1.3 采用Western blot法检测检测肾组织纤维化相关指标表达 取肾脏皮质组织，快速放于液氮急冻，保存于-80℃冰箱中。取部分肾组织按照按Western blot标准实验操作步骤操作，一抗二抗购置于美国Cell Signaling Technology 公司，抗体稀释比例按照说明书建议操作。以β-actin 作为内参照，采用上海天能仪器机器自带系统分析图像。

1.4 采用实时荧光PCR(RT-PCR)检测肾组织中Mst1-Nrf2通路蛋白mRNA的表达 肾组织用Trizol处理提取总RNA，并用反转录试剂盒反转录为cDNA，并进行PCR扩增，再采用荧光定量PCR试剂盒在ABI 7300机器检测，以GAPDH为内参，ΔΔct 法进行相对定量。每样本至少重复3次独立实验。

1.5 采用PAS染色观察肾组织肾小球硬化和间质纤维化情况 取肾组织按免疫组化福尔马林固定、梯度酒精脱水并浸入石蜡等步骤后，使用石蜡切片机切片后染色观察。免疫组化所使用的一抗购自美国Cell Signaling Technology 公司。

2 结果

2.1 3组大鼠肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿蛋白、血胆固醇、可溶性尿激酶受体检测结果 3组大鼠血清肌酐Scr、尿素氮、血清白蛋白、可溶性尿激酶受体、24 h尿蛋白定量。结果发现，模型组和相对于对照组的所检测指标均有恶化加重(P<0.5)。而实验组较模型组各项指标均有缓解。见表1。

表1 3组大鼠肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿蛋白、血胆固醇、可溶性尿激酶受体检测结果

2.2 3组大鼠肾组织丙二醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性比较 模型组大鼠肾组织丙二醛含量明显高于对照组(P<0.01)。实验组丙二醛水平较模型组明显降低。对照组和模型组GSH水平无显著性差异，而实验组GSH水平高于其他各组。与对照组相比，模型组肾组织GSH过氧化物酶和过氧化氢酶活性显著降低。而实验组肾组织GSH过氧化物酶和过氧化氢酶活性降低程度小于模型组。见表2。

表2 3组大鼠肾组织丙二醛、还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性结果

2.3 采用RT-PCR检测肾组织中Mst1和Nrf2的mRNA表达 相比对照组，模型组的Mst1的mRNA表达上调，Nrf2的mRNA表达下调。而实验组较模型组Mst1的mRNA表达减少，而Nrf2的mRNA表达增加。见表3。

表3 RT-PCR检测肾组织中Mst1和Nrf2的mRNA表达

2.4 采用Western Blot 和RT-PCR 检测肾脏纤维化指标Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β的表达来衡量肾小球硬化和间质纤维化发展情况 模型组较对照组各纤维化指标表达明显上调，而实验组纤维化指标的表达被不同程度抑制。故鞣花酸能有效逆转阿霉素诱导的FSGS 大鼠肾组织纤维化进程。见表4，图1。

表4 RT-PCR检测Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β的mRNA表达

图1 鞣花酸对阿霉素诱导的FSGS大鼠肾脏纤维化指标的影响，Western Blot检测Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β蛋白表达

2.5 PAS染色法可以用来检测组织中的糖类使其呈现紫红色 模型组的肾组织表现为明显的肾小球硬化和间质纤维化，但当鞣花酸处理后的实验组肾小球病理损伤明显减轻。见图2。

对照组模型组实验组

3 讨论

肾小球疾病常因足细胞损伤而临床表现为蛋白尿，可引起进行性肾小球硬化[1,2]。FSGS是一种常见的原发性肾小球病变，部分患者最终可进展为ESRD，对患者生存质量造成严重不良影响[4]。而FSGS发病机制还不明确，目前已有研究证明氧化应激和炎性反应在其病生理过程中发挥了重要作用[1]，会对足细胞的组织结构及生理功能产生影响，引起进行性肾小球硬化[13]。已有研究证实Mst1-Nrf2通路参与细胞氧化应激和炎性反应[8,9]。

已有研究证实，FSGS有多种造模方法，比较常用和公认的采用尾静脉注射阿霉素诱导造模，这是因为阿霉素的肾毒性较强，能诱导氧化应激反应、抑制肾小球足细胞周期，与人FSGS相近，临床表现为肾病综合征。在本研究中发现，鞣花酸在阿霉素诱导的FSGS大鼠通过抑制Mst1蛋白和促进Nrf2蛋白的产生，从而减弱肾组织的氧化应激和炎性反应，延缓FSGS 的病理进程，发挥肾脏保护作用。

鞣花酸为天然多酚，多项研究证明其具有抗氧化、抗炎等等多种生物活性。本研究结果证明在使用鞣花酸处理阿霉素诱导的FSGS大鼠模型后，大鼠的肾功

能、血浆白蛋白、24 h尿蛋白定量、血胆固醇水平、可溶性尿激酶受体、肾组织ROS等指标均得到改善，肾组织GSH过氧化物酶和过氧化氢酶活性降低，肾小球硬化和间质纤维化也在病理损伤上得到减轻，有助于维持机体的正常生理功能。结果证明鞣花酸能缓解阿霉素诱导的FSGS大鼠肾脏结构和功能病变情况，且其可能通过Mst1-Nrf2通路抑制炎性反应和氧化应激而发挥作用。

综上，鞣花酸可以缓解阿霉素诱导的FSGS大鼠肾脏病变，在FSGS防治中具备潜在临床运用价值，详细的分子机制尚不完全明确，有待进一步研究。